于晶晶,王婭娜,于辛酉,師志云,卜 陽,趙巍

2.寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院,銀川 750004

細粒棘球蚴病又稱包蟲病,是全球性的人獸共患寄生蟲病。在我國甘肅、寧夏、青海、新疆等西部地區(qū)及相鄰地區(qū)流行〔1〕。根據(jù)幾個重點流行省區(qū)的不完全統(tǒng)計,估計我國受細粒棘球蚴病威脅的人口約在5 000萬人以上,棘球蚴病患者人數(shù)約50-60萬人〔2〕。由于包蟲病發(fā)病緩慢,易于傳播,并且至今沒有一種有效的預防措施,因而嚴重威脅當?shù)厝嗣竦慕】岛托竽翗I(yè)的發(fā)展。隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展和廣泛應用,極大的推動了基因工程疫苗在預防各種傳染病和寄生蟲病的應用研究。本研究在已克隆 Eg.zw-5基因的基礎(chǔ)之上〔3〕,構(gòu)建表達質(zhì)粒,獲取重組蛋白,并對重組蛋白的免疫學特性進行初步分析。以期為篩選新包蟲病疫苗打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌種 zw-5/p GEM-T/JM109〔3〕為本室構(gòu)建。表達載體pET28a購自Novagen公司。大腸埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)p LysS由Saskatchewan大學肖偉博士饋贈。

1.2 主要試劑儀器 限制性內(nèi)切酶Bam HⅠ、NotⅠ和T4連接酶、IPTG購自 PROMEGA公司;酵母提取物、蛋白胨為OXOID公司產(chǎn)品;質(zhì)粒提取試劑盒購自上海華舜公司;DNA回收試劑盒購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司;200bp DNA Marker、Lambda DNA/Hin d IIIMarker、低分子質(zhì)量Marker、預染Marker、HRP標記的羊抗鼠IgG購于北京華美生物工程公司;重組蛋白純化試劑盒購自Novagen公司;弗氏完全和不完全佐劑購自Sigma公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。紫外分光光度儀(DMS200型)美國Varian公司產(chǎn)品;凝膠成像儀和分析軟件、蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)印裝置、酶聯(lián)免疫檢測儀、洗板機均為BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.3 實驗動物 6w齡雌性ICR小鼠,體重(18±2)g,共48只,購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.4 重組表達質(zhì)粒Eg.zw-5/p ET28a/BL21(DE3)的構(gòu)建及鑒定 用Bam HⅠ、NotⅠ同時對已構(gòu)建的Eg.zw-5/pGEM-T/JM109重組質(zhì)粒和p ET28a進行雙酶切,將目的片段與表達載體p ET28a在T4連接酶的作用下,4。C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細菌E.coli BL 21(DE3),并在含有卡那霉素(終濃度為50μg/mL)的YT培養(yǎng)基中,37。C培養(yǎng)過夜。篩選陽性菌落提取質(zhì)粒,用Bam HⅠ和Not I酶切鑒定。將含有重組質(zhì)粒的菌株送大連寶生物有限公司進行目的基因測序、鑒定。

1.5 重組蛋白的表達 將重組菌接種于含卡那霉素(終濃度為 50μg/mL)的 3mL YT培養(yǎng)基中,37。C,220r/min振蕩培養(yǎng)數(shù) h,按1∶50接種于50mL培養(yǎng)基中,37。C,220r/min,培養(yǎng)至OD600=0.6時,加入IPTG至終濃度為0.4mmol/L,分別25。C、28。C、30。C、37。C振蕩培養(yǎng)過夜,優(yōu)化誘導表達條件。4 000r/min離心10min,棄上清,收集細菌沉淀和誘導表達前的菌液,進行SDS-PAGE鑒定。

1.6 重組zw-5包涵體的鑒定 將37。C誘導表達收集的菌體,用1×PBS洗三遍后,加入無變性劑的1×Binding buffer充分重懸。在超聲裂解強度40%的條件下裂菌30min。7 500r/min,4。C離心15min,分別收集上清和沉淀制樣,12%SDS-PAGE鑒定。將超聲裂菌收集的細菌沉淀按1mL細菌中加2mL含6mol/L尿素的1×Binding buffer的比例重懸。冰上1h后,12 000r/min,4。C離心30min。收集上清,用0.45μm濾膜過濾。

1.7 表達產(chǎn)物的純化 由于Eg.zw-5/his是含6個his的融合蛋白,可以用Novagen購買的含Ni2+的His-bind樹脂親合層析柱進行蛋白的純化。將誘導后的菌液裂解,并收集上清(含尿素)。用樹脂懸液、1×Charge buffer和 1×Binding buffer含6mol/L尿素處理平衡柱床。將菌液上清加入柱床中,并依次用 1×Binding buffer含 6mol/L尿素、1×Wash buffer含 6mol/L尿素、1×Elut buffer含6mol/L尿素洗脫樹脂上結(jié)合的蛋白,得到包涵體蛋白。將包涵體蛋白放入透析袋中以去除尿素。SDS-PAGE鑒定純化蛋白,用標準分子量 Marker根據(jù)Bio-Rad公司的Gel Doc1000凝膠分析系統(tǒng)對蛋白進行定量。

1.8 特異性抗血清的制備及重組蛋白的免疫原性鑒定

1.8.1 特異性抗血清的制備(1)小鼠免疫將ICR小鼠隨機分為4組每組12只。A組:10μg Eg.zw-5/His+佐劑+PBS組;B組:佐劑+PBS對照組;C組:空白對照組;(2)免疫方法A、B兩組小鼠在0、2、4w各免疫1次,一共 3次。第1次基礎(chǔ)免疫用弗氏完全佐劑,以后2次為加強免疫均用弗氏不完全佐劑。采用背部皮下多點注射免疫,每次注射量為100μL/只。分別于0、2、4、6、8w 從鼠尾靜脈各采血1次,一共5次。(3)制備抗血清 將血液4 000r/min離心10min,吸取血清,-85。C保存。

1.8.2 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western-blot) 特異性血清的免疫識別粗制Eg.zw-5/His重組抗原、BL21(DE3)p LysS的表達產(chǎn)物及原頭蚴、囊液、通過180V電壓SDS-PAGE電泳1h,按常規(guī)方法(電流300mA)印跡轉(zhuǎn)移1h。然后將硝酸纖維膜浸入5%的脫脂奶粉溶液中,37。C封閉2h,以1×PBS-T(含0.5‰Tween-20)洗3次,每次5min。將硝酸纖維膜剪開分別浸泡于1∶100稀釋的蛋白免疫的特異性小鼠抗血清及對照組鼠血清中,4。C過夜;洗滌后將膜與1∶100稀釋的羊抗鼠IgG-辣根過氧化物酶(HRP)在 37。C搖床上 60r/min反應 2h,再以 1×PBS-T溶液洗4次,每次10min,加入新配制的顯色液(6mg 4-氯-1-奈酚,2mL冷甲醇,10mL 1×TBS,12μLH2O2)顯色 5min,最后用蒸餾水沖洗終止反應。

1.8.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 用終濃度為10μg/mL的Eg.zw-5/His重組蛋白包被96孔酶標板,每孔100μL,4。C過夜,洗板 4次后,5%脫脂奶粉37。C封閉2h;加入1∶100稀釋的相應 A、B、C組鼠血清,100μL/孔,37。C孵育 2h,洗板 4次;加入 1∶800稀釋的羊抗鼠IgG-HRP 100μL/孔,37。C孵育2h,洗板4次;加入新配的顯色液(70mL基質(zhì)液,700μL 6mg TMB/1mL DMSO,252μLH 2 O2)顯色20min,用2mol/L H2SO4每孔 50μL終止反應。將酶標板放入BIO-RAD公司 550型酶標儀上測定450 nm波長處吸光值(OD值),用SPSS統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 Eg.zw-5/p ET28a重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果 將構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒Eg.zw-5/p ET28a用限制性內(nèi)切酶Bam H I和Not I雙酶切后,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測到插入片段大小約624bp,與目的基因片段大小相符(圖1)。

圖1 Eg.zw-5/p ET28a重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant zw-5/p ET 28a vetcor

圖2 Eg.zw-5在上清和沉淀的表達量Fig.2 Eg.zw-5 expression amount in supernatant and sediment

2.2 Eg.zw-5包涵體的鑒定 將菌體裂解液的上清和沉淀分別作SDS-PAGE,考馬斯亮蘭染色后在沉淀中大約28kD位置有一濃染的蛋白條帶,而上清中約28k D處條帶色淺灰。結(jié)果表明:Eg.zw-5在大腸埃希菌中是以包涵體存在的。

2.3 Eg.zw-5/His的純化 經(jīng)IPTG誘導,Eg.zw-5/p ET28a基因能在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中表達,形成Eg.zw-5/His重組蛋白,并通過Ni2+的His-bind樹脂親合層析柱進行蛋白的純化,根據(jù)標準分子量蛋白的位置可知純化的重組蛋白的分子量約28k D(圖 3)。

圖3 SDS-PAGE鑒定純化重組蛋白Fig.3 Identification of purified reconmbinant protein by SDS-PAGE

2.4 Western-blot實驗結(jié)果 用抗原免疫的小鼠血清識別重組蛋白和天然抗原原頭蚴(不能識別天然抗原囊液),可見在約28k D處有明顯識別條帶,表明該重組蛋白具有很強的抗原活性,但以上條帶均不被對照組鼠血清識別(圖4)。

圖4 重組蛋白免疫鼠血清免疫印跡分析Fig.4 Western-blot analysis with experimental antiserum

2.5 免疫鼠血清抗體水平 分別用蛋白含量為5mg/mL的Eg.zw-5/His,蛋白含量為10mg/mL的囊液和原頭蚴勻漿液包板,用不同組的小鼠血清分別與之結(jié)合反應,終止反應后在酶標分析儀上測定450nm波長處光吸收值(OD值),用ELISA方法測定 A、B、C三組 Eg.zw-5免疫鼠血清抗體,經(jīng)SPSS統(tǒng)計軟件分析,結(jié)果見表1、表2。結(jié)果顯示:免疫前各組間無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);免疫2w周、4w、6w、8w,A、B組與C組間比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。前3次免疫抗體滴度逐漸升高,至第6w抗體滴度達到最高值,此后逐漸下降。免疫后6w小鼠血清特異性識別原頭蚴、囊液。原頭蚴包板A組、B組分別與 C組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。囊液包板A組、B組分別與C組比較沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

表1 用重組蛋白包被的ELISA測定結(jié)果(OD值)Tab.1 ELISA outcome of recombinant antigen

表2 用天然蛋白包被的ELISA測定結(jié)果(免疫6w血清檢測)Tab.2 ELISE outcomeof natural antigen tested with six antiserum

3 討 論

近年來,利用基因工程技術(shù)發(fā)展包蟲疫苗已經(jīng)成為包蟲病防治研究的熱點〔4〕,并確定了一些較有希望的候選疫苗分子.現(xiàn)在已經(jīng)篩選出重組Eg.95疫苗并證實其具有高度、有效的保護力〔5〕,但由于缺乏更多的疫苗候選分子對于成蟲感染后的免疫機制方面的研究,包蟲病的控制仍然在我國是一個重大的醫(yī)學問題。由于包蟲生活史復雜,有多個發(fā)育階段,抗原成分多,因此廣泛篩選新的候選抗原分子,并用基因重組技術(shù)制備重組抗原(基因工程疫苗),采用多種抗原伍用、針對多個發(fā)育階段的多價復合疫苗聯(lián)合免疫以增強其免疫效果,是今后包蟲疫苗的發(fā)展方向〔7-10〕。本課題組在已研究細粒棘球蚴P29、HSP70、14-3-3 、鐵蛋白〔11-15〕等的基礎(chǔ)上進一步篩選出新的候選抗原分子zw-5,并對其在細粒棘球蚴感染的小鼠中做了初步的免疫學機制的研究。

經(jīng)DNAman軟件對本室擴增的細粒棘球蚴zw-5基因序列分析發(fā)現(xiàn),該基因的序列長度為624bp。在NCBI/BLAST公共數(shù)據(jù)庫中對 Gen-Bank中檢索的原序列(烏拉圭株)和克隆的中國大陸株zw-5序列進行比較發(fā)現(xiàn):核苷酸序列的同源性達 99%〔3〕。Thompson R C A〔6〕研究認為細粒棘球絳蟲在不同地域和不同中間宿主中可發(fā)育成不同的蟲株,從而導致其流行病學特征和致病性不同,同時由于外在環(huán)境及條件的不同使得寄生蟲在長期的演化過程中遺傳基因可發(fā)生改變,據(jù)此我們考慮該基因的變化可能因地域差異所造成,是我國細粒棘球蚴蟲蟲株所特有的,因此它作為預防當?shù)匕x病疫苗可能具有更好的特異性和針對性,同時可能在蟲株的鑒別診斷方面也有著一定的應用價值。

鑒于本序列為中國蟲株的特有序列與烏拉圭株的zw-5序列具有差異性,我們已將該基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進行注冊,并獲得GenBank登陸號為:EU266756。

本次研究在已成功克隆Eg.zw-5基因的基礎(chǔ)上,高效表達且利用純化的重組蛋白Eg.zw-5/his免疫小鼠獲得抗血清。Western-blot結(jié)果顯示純化的重組蛋白免疫小鼠得到的抗血清,不僅能特異性識別重組蛋白,也能識別原頭蚴中相應抗原,而對照組鼠血清均未見反應條帶,表明重組蛋白與天然蟲體抗原具有共同的抗原表位。用三種不同來源的蛋白(重組蛋白、天然抗原原頭蚴和囊液)作為抗原包板的ELISA數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果顯示,重組蛋白組血清的抗體IgG含量分別與佐劑+PBS對照組、空白對照組血清的抗體IgG含量差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。免疫后6w小鼠血清特異性識別原頭蚴、囊液。原頭蚴包板A組、B組分別與C組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。囊液包板A組、B組分別與C組比較沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

兩種實驗結(jié)果說明,重組抗原具有較好的抗原性和免疫原性,有望成為包蟲疫苗的侯選抗原。但重組抗原是否抑制棘球蚴蟲的生長或能否起到殺蟲減囊作用,還需進一步的動物攻擊感染保護性試驗證實。

〔1〕章家新,傅玉才.包蟲病的疫苗研究進展〔J〕,汕頭大學醫(yī)學院學報,2002,15(2):118-120.

〔2〕葉爾江,蘇里唐,江莉.我國棘球蚴病防治研究進展〔J〕.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2000,18(3):179-181.

〔3〕趙嘉慶,王健,王婭娜,等.細粒棘球蚴中國大陸株ZW-5基因的生物信息學分析〔J〕.寧夏醫(yī)學院學報,2005,27(2):85-87.

〔4〕Lightowlers MW,Gauci CG.Vaccines against cysticercosis and hydatidosis〔J〕.Vet Parasitol,2001,101(3-4):337-352.

〔5〕Thompson RCA,Lymbery AJ.Echinococcus and hydatid disease〔M〕.Oxon:CAB International,1995,1-50.

〔6〕Lightowlers MW,Jensen O,Fernandez E,et al.Vaccination trials in Australia and Argentina confirm the effectiveness of the EG95 hydatid vaccine in sheep〔 J〕.Int J Parasitol,1999,29(4):531-534.

〔7〕Yang Y,Sun T,Li Z,et al.Community survey s and risk factor analysis of human alveolar and cystic echinococcosis in Ningxia Hui Autonomous Region,China〔J〕.Bull World Health Organ,2006,84(9):714-721.

〔8〕Craig PS,Larrieu E.Control of cystic echinococcosis/hydatidosis:1863-2002〔J〕.Adv Parasitol,2006,61:443-508.

〔9〕Craig PS,McManus DP,Lightowlers MW,et al.Prevention and control of cystic echinococcosis〔J〕.Lancet Infect Dis,2007,7(6):385-394.

〔10〕師志云,李昭宇,等.細粒棘球絳蟲(中國大陸株)診斷抗原P229基因的表達、純化及免疫原性初步分析〔J〕.中國人獸共患病學報,2009,25(11):1065-1067.

〔11〕黃瑾,李宗吉,張靜,等.細粒棘球蚴重組14-3-3基因的表達、純化及免疫學鑒定〔J〕.中國病原生物學雜志,2006,1(4):253-256.

〔12〕李宗吉,黃瑾,張靜,等.細粒棘球蚴谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶重組抗原的高效融合表達、純化及免疫特性的研究〔J〕.中國人獸共患病學報,2007,23(1):76-79.

〔13〕張靜,王潔,王淑靜,等.細粒棘球蚴(中國大陸株)線粒體蘋果酸脫氫酶重組蛋白的表達、純化及免疫特性分析〔J〕.中國病原生物學雜志,2006,1(4):249-252.

〔14〕王婭娜,丁淑琴,王潔,等.細粒棘球蚴鐵蛋白基因的克隆重組、高效表達及免疫學初步研究〔J〕.中國人獸共患病學報,2006,22(5):399-406.

〔15〕丁淑琴,王潔,王淑靜,等.細粒棘球蚴2HSP70重組質(zhì)粒的構(gòu)建、原核表達、純化和初步鑒定〔J〕.中國人獸共患病學報,2006,22(8):764-766.