王 敏,李文桂,蔡世飛,周必英

rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸蟲病患者的診斷價值*

王 敏,李文桂,蔡世飛,周必英

目的探討rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸蟲病患者的診斷價值。方法利用純化的rSj26-Sj32融合蛋白和日本血吸蟲成蟲抗原(SjAWA)建立HRP-IgG-Dot-ELISA檢測急性日本血吸蟲病患者血清,并以華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病、棘球蚴病、乙型肝炎、肺結(jié)核病患者和健康人血清作對照,觀察二者的檢測結(jié)果。結(jié)果rSj26-Sj32和SjAWA檢測急性日本血吸蟲病患者陽性檢出率均為100%,特異性分別為95.35%和93.02%;二者均與華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病和泡型棘球蚴病患者血清存在不同程度的交叉反應(yīng)。結(jié)論純化的rSj26-Sj32融合蛋白是一種較好的免疫診斷抗原。

日本血吸蟲病;rSj26-Sj32融合蛋白;Dot-ELISA法;免疫診斷

日本血吸蟲病是由日本血吸蟲(Schistosoma japonicum,Sj)引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患寄生蟲病,是國家衛(wèi)生部規(guī)劃防治的五大寄生蟲病之一。中國現(xiàn)癥患者67.12萬人,病牛2.48萬頭,釘螺面積38.01億平方米,受威脅人口4 000萬以上〔1〕。開發(fā)高度敏感和特異的標(biāo)準(zhǔn)化免疫診斷試劑是當(dāng)前日本血吸蟲病研究的重點(diǎn)內(nèi)容。Sj26是一個較好的診斷抗原分子,王細(xì)宏等〔2〕發(fā)現(xiàn)重組Sj26能夠識別抗Sj26的 IgG抗體,通過間接ELISA檢測急性日本血吸蟲病患者血清的敏感性為90.6%,并具有較高的特異性。石佑恩等〔3〕采用酶聯(lián)免疫印漬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Sj有31/32kDa(Sj31/32),并證明其具有較高的診斷價值。本研究利用rSj26-Sj32-H RP-IgG-Dot-ELISA檢測急性日本血吸蟲病患者血清,并與日本血吸蟲成蟲粗抗原(SjAWA)H RP-IgG-Dot-ELISA檢測相比較,觀察rSj26-Sj32融合蛋白用于診斷急性日本血吸蟲病的價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清標(biāo)本 急性日本血吸蟲病患者血清50份由武漢市衛(wèi)生局王家剛老師惠贈;華支睪吸蟲病患者血清21份、衛(wèi)氏并殖吸蟲病患者血清13份、泡型棘球蚴病患者血清10份、囊型棘球蚴病患者血清9份和肺結(jié)核病患者血清20份由本室保存。正常人血清43份和乙型肝炎患者血清20份由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院羅亞老師惠贈。

1.1.2 試劑及儀器 BL21(pET28α-Sj26-Sj32)重組菌由本室保存,HRP標(biāo)記的羊抗人IgG購自SouthernBiotech公司,Ni-NTA試劑盒購自QIAGEN公司,酶標(biāo)儀購自Bio-tek公司,BioRad Gel Doc 1000凝膠成像儀購自Bio-Rad公司,硝酸纖維素膜購自重慶鼎今公司。

1.1.3 Dot-ELISA測定裝置 參照丁建祖〔4〕的方法進(jìn)行制作。塑料小盒為4cm×3cm×0.6cm的扁盒,分為底、蓋兩部分,蓋中央有直徑0.5cm的圓孔;盒內(nèi)充滿吸水墊料,市售圓筒紙手工折疊而成,蓋孔下緊貼墊料;墊料上放置硝酸纖維素膜(NC膜)一片,硝酸纖維膜片為1.0cm×1.5cm長方形條塊,在pH 為7.4的PBS中浸泡30min,待其自然干燥后裝入測定裝置。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒 pET28α-Sj26GST-Sj32在大腸埃希菌BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá) 經(jīng)鑒定含有重組質(zhì)粒 pET28α-Sj26GST-Sj32的大腸埃希菌BL21(DE3)在含卡那霉素的 LB培養(yǎng)基中37℃250 r/min振搖培養(yǎng)至A值0.5～0.8時,取適量作為未誘導(dǎo)對照,其余加入終濃度為 1 mmol/L的IPTG 于37 ℃誘導(dǎo)表達(dá),分別在誘導(dǎo)后1、3、5、7、9、11和13 h各收集1 mL菌液。

1.2.2 重組質(zhì)粒 pET28α-Sj26GST-Sj32表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 上述菌液10 000 r/min離心2min,分別收集菌體,以50μ L的 1×蛋白上樣緩沖液重懸后煮沸5 min,取20μ L用5%的濃縮膠和10%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳,以考馬斯亮藍(lán)染色,脫色后經(jīng)BioRad薄層凝膠掃描分析系統(tǒng)分析重組蛋白的表達(dá)情況。

1.2.3 rSj26-Sj32抗原純化 將上述收集的細(xì)菌沉淀用 PBS重懸,超聲粉碎后 5 000r/min離心10min,利用pET表達(dá)載體攜帶的聚組氨酸(Histag)標(biāo)簽,用Ni-NTA試劑盒純化,按說明書操作,測定其蛋白濃度為0.21mg/mL,用雙蒸水稀釋至0.1μ g/μ L。分別取不同培養(yǎng)時間誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白20μ L用5%的濃縮膠和10%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳,以考馬斯亮藍(lán)染色,脫色后經(jīng)BioRad薄層凝膠掃描分析系統(tǒng)分析重組蛋白的表達(dá)情況。

1.2.4SjAWA制備 日本血吸蟲成蟲粗抗原(AWA),按報道方法制備〔5〕。從感染2 000條日本血吸蟲尾蚴后43d的家兔體內(nèi)收集成蟲,低溫干燥后加入適量PBS,冰浴下磨成勻漿,反復(fù)凍融,低溫離心(10 000r/min)30min,取上清即為AWA,測定蛋白濃度為2.01mg/mL,用雙蒸水稀釋至1μ g/μ L。

1.2.5 rSj26-Sj32和SjAWA抗原包被濃度以及血清稀釋度選擇 在進(jìn)行Dot-ELISA實(shí)驗(yàn)時,先進(jìn)行 ELISA 實(shí)驗(yàn) ,按 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0μ g/孔的rSj26-Sj32融合蛋白包板(抗原包被液200μ L/孔),按 0.2、0.4、0.6、0.8 、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2 和 2.4μ g/孔SjAWA 包板;血清按1∶100、1∶200、1∶400和 1∶800稀釋;1∶1 000羊抗人IgG的工作濃度;在常規(guī)操作下檢測10份日本血吸蟲病患者混合血清(陽參)和10份健康人混合血清(陰參),以陽參/陰參的A值之比最大、PBS對照本底最低時選擇為最適條件。將10份日本血吸蟲病患者混合血清和10份健康人混合血清分別以1∶50、1∶100、1∶200、1∶400和 1∶800稀釋度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),以陽性血清吸光度OD450值與正常對照血清OD450值的比值(S/N)最大時的稀釋度為最佳稀釋度。

1.2.6 rSj26-Sj32/SjAWA-HRP-IgG-Dot-ELISA

每孔NC膜中央點(diǎn)加 rSj26-Sj32融合蛋白 4μ L(0.1μ g/μ L)和 SjAWA 2μ L(1μ g/μ L),室溫干燥;后加入封閉液200μ L,室溫干燥;分別加1∶50待檢稀釋血清100μ L,37℃孵育1h;加入 1∶1 000稀釋H RP-IgG 抗體 100μ L,37℃孵育 30min;加底物液50μ L,37℃孵育 20min;最后加 2mmol/L H2SO450μ L終止反應(yīng)。5min內(nèi)肉眼觀察結(jié)果,若在NC膜上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)為陽性,否則為陰性。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 rSj26-Sj32和SjAWA Dot-ELISA檢測的敏感性和特異性比較用卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒 pET28α-Sj26GST-Sj32在大腸埃希菌BL21(DE3)中的表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析重組質(zhì)粒pET28α-Sj26GST-Sj32轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),菌體蛋白的SDSPAGE結(jié)果顯示其分子質(zhì)量單位約為69 kDa,與預(yù)期值相符。薄層掃描分析顯示Sj26GST-Sj32融合蛋白占菌體總蛋白的25%,且在IPTG誘導(dǎo)5 h～7 h蛋白表達(dá)量最高(圖1)。

2.2 純化的 rSj26-Sj32的 SDS-PAGE分析BL21(pET28α-Sj26-Sj32)培養(yǎng)至對數(shù)生長期,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)7h的表達(dá)產(chǎn)物利用Ni-NTA試劑盒純化,然后進(jìn)行 SDS-PAGE電泳,純化后的 rSj26-Sj32在約69kDa處有明顯的蛋白表達(dá)條帶,其分子量與預(yù)期值相符(圖2)。

2.3 rSj26-Sj32、SjAWA包被濃度和血清稀釋度選擇 在進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)時,rSj26-Sj32和SjAWA 的包被濃度分別為 0.4μ g/孔和 2μ g/孔時,二者的陽參/陰參的A值之比分別為最大;血清稀釋度為1∶50時,其陽性血清吸光度OD450值與正常對照血清OD450值的比值(S/N)最大。因此在進(jìn)行Dot-ELISA實(shí)驗(yàn)時,rSj26-Sj32和SjAWA的包被濃度分別選擇0.4μ g/孔和 2μ g/孔,血清稀釋度為1∶50。

圖1 重組質(zhì)粒pET28α-Sj26-Sj32表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE分析1:蛋白marker;2:未誘導(dǎo)的BL21(pET28α-Sj26-Sj32);3-9:1mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)1,3,5,7,9,11和13小時的BL21(pET28α-Sj26GST-Sj32)產(chǎn)物Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant plasmid pET28α-Sj26-Sj32 expression product1:Protein marker;2:BL21(pET28α-Sj26-Sj32)withoutinduction;3-9:BL21(pET28α-Sj26-Sj32)induced with 1mmol/L IPTG for 1,3,5,7,9,11 and 13h

圖2 rSj26GST-Sj32蛋白純化的SDS-PAGE分析1:蛋白marker;2-5:1mmol/L IPTG分別誘導(dǎo)1,3,5和7h的BL21(pET28α-Sj26GST-Sj32)產(chǎn)物 6-9 純化的rSj26GST-Sj32蛋白Fig.2 SDS-PAGE analysis ofthepurified rSj26GSTSj32 protein1:Protein marker;2-5:BL21(pET28α-Sj26GSTSj32)induced with 1mmol/L IPTG for 1,3,5 and 7h;6-9:Purified rSj26GST-Sj32 protein

2.4 Dot-ELISA檢測 rSj26-Sj32和SjAWA檢測急性日本血吸蟲病患者的陽性率均為100%,二者檢出率無差異;特異性分別為 95.35%和93.02%;rSj26-Sj32與華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病和泡型棘球蚴病患者血清的交叉反應(yīng)率分別為9.52%、15.38%和10.00%,SjAWA與華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病和泡型棘球蚴病患者血清的交叉反應(yīng)率分別為14.29%、23.08%和20.00%;兩種抗原均與囊型棘球蚴病、乙型肝炎和肺結(jié)核病人血清未見交叉反應(yīng) (表 1)。rSj26-Sj32-IgG-Dot-ELISA診斷急性日本血吸蟲病的陽性預(yù)告值、陰性預(yù)告值和診斷效率分別為96.15%、100%和97.88%,而SjAWA-IgG-Dot-ELISA診斷急性日本血吸蟲病的陽性預(yù)告值、陰性預(yù)告值和診斷效率分別為94.34%、100%、96.77%。

3 討 論

Ni-NTA中Ni2+有4個共價鍵與NTA結(jié)合,使得Ni與NTA結(jié)合更牢固,脫落率低,可提高蛋白純度并減少Ni2+脫落造成的環(huán)境污染。本研究利用Ni-NTA純化試劑盒對 BL21(pET28α-Sj26-Sj32)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)7 h后收集的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化,獲得純化的蛋白濃度為0.21μ g/μ L,同時純化后的rSj26-Sj32在約69ku處有明顯的蛋白表達(dá)條帶,其濃度和分子量均達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

表1 rSj26-Sj32-IgG-Dot-ELISA用于急性日本血吸蟲病患者的診斷價值Tab.1 The immunodiagnostic value of rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA on patients with acute schistosomiasis japonica

抗體IgG與日本血吸蟲急性感染、慢性感染及再感染關(guān)系密切,急性日本血吸蟲病人的IgG含量與慢性血吸蟲病人相近,均遠(yuǎn)高于正常人。檢測特異性IgG具有較高的診斷價值和部分療效考核價值〔6-8〕。王志成等〔9〕發(fā)現(xiàn) rSj26對急性日本血吸蟲病患者血清檢測的陽性率為92%。舒新華等〔10〕用rSj32、SjAWA和SEA分別檢測日本血吸蟲病、華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病患者和健康人血清,發(fā)現(xiàn)rSj32用于檢測日本血吸蟲病的敏感性和特異性與蟲源性抗原AWA和SEA的差異無顯著性。與常規(guī)ELISA比較,Dot-ELISA反應(yīng)時間短,重復(fù)性好,實(shí)驗(yàn)所需血清及酶標(biāo)抗體用量極少,方法簡便,采用室溫孵育和肉眼觀察判斷結(jié)果,無需特殊儀器,便于大規(guī)模檢測。本研究利用獲得的rSj26-Sj32建立Dot-ELISA法檢測急性日本血吸蟲病患者血清發(fā)現(xiàn)陽性檢出率為100%,與SjAWA的陽性檢出率一致,特異性分別為95.35%和93.02%,無顯著差異(χ2=0,P＞0.05);rSj26-Sj32和SjAWA均與華支睪吸蟲病、衛(wèi)氏并殖吸蟲病和泡型棘球蚴病患者血清存在不同程度的交叉反應(yīng),但無顯著差異,提示rSj26-Sj32與SjAWA具有相似的敏感性和特異性,表明rSj26-Sj32融合抗原是一種有價值的診斷抗原,值得擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步觀察。

陽性預(yù)測告值是指在人群中對某種疾病進(jìn)行篩檢時,被試人如為陽性時所患該病的概率。陰性預(yù)測值是指在人群中對某種疾病進(jìn)行篩檢時,被試人為陰性時無該病的概率。陽性預(yù)測值與診斷試驗(yàn)的靈敏度和特異度有關(guān)。診斷試驗(yàn)的特異度越高,陽性預(yù)告值越高;診斷試驗(yàn)的靈敏度越高,陰性預(yù)測值越高。本研究利用rSj26-Sj32檢測急性日本血吸蟲病患者的陽性預(yù)告值、陰性預(yù)測值和診斷效率與SjAWA的相似,二者無顯著差異。

〔1〕郝陽,吳曉華,鄭浩,等.2007年全國血吸蟲病疫情通報〔J〕.中國血吸蟲病防治雜志,2008,20(6):401-404.

〔2〕王細(xì)宏,羅飛,沈繼龍.重組日本血吸蟲谷胱甘肽-硫-轉(zhuǎn)移酶單克隆抗體在急性血吸蟲病臨床診斷中的應(yīng)用〔J〕.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2008,23(6):578-581.

〔3〕石佑恩,Dell R,Diesfeld HJ,等.日本血吸蟲成蟲31/32kDa診斷蛋白與血吸蟲單克隆抗體和病人血清的免疫印斑反應(yīng)〔J〕.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志,1988,6(4):245-247.

〔4〕丁建祖,干小仙,沈惠英,等.快速檢測抗日本血吸蟲抗體的金標(biāo)免疫滲濾法的建立及應(yīng)用〔J〕.中國寄生蟲病防治雜志,1998,11(4):308-310.

〔5〕趙巍,蘇川,吳海偉,等.日本血吸蟲(中國大陸株)22.6kDa重組抗原的免疫原性研究〔J〕.中國人獸共患病雜志,l998,14(3):24-27.

〔6〕魏泉徳,石佑恩,血吸蟲病治療前后IgG及其亞類的變化和療效考核的研究〔J〕.中國人獸共患病雜志,1998,14(1):30-32.

〔7〕Rabello AL,Garcia MM,da Silva RA,et al.Humoral immune responses in acute schistosomiasis mansoni:relation to morbidity〔J〕.Clin Infect Dis,1995,21(3):608-615.

〔8〕Bocter FN,Peter JB.IgG subclasses in human chronic schistosomiasis:over-production ofSchistosoma-specific and non-specific IgG4〔J〕.Clin Exp Immunol,1990,82(3):574-578.

〔9〕王志成,徐元宏,汪學(xué)龍,等.日本血吸蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶在蟲卵階段的定位〔J〕.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,42(1):1-4.

〔10〕舒新華,周金春,蔡春,等.日本血吸蟲重組 32kDa抗原的純化和診斷應(yīng)用〔J〕.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,1998,23(4):331-334.

Immunodiagnostic value of rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA for patients with acute Schistosomiasis japonica

WANG Min,LI Wen-gui,CAI Shi-fei,ZHOU Bi-ying
(Instituteof Infectious and Parasitic Diseases,the First Af f iliated Hospital,
Chongqing Medical University,Chongqing400016,China)

To study the immunodiagnostic value of rSj26-Sj32-HRP-IgG-Dot-ELISA for patients with acute Schistosomiasis japonica,sera from parients were detected by HRP-IgG-Dot-ELISA which established by purified rSj26-Sj32 fusion protein andSchistosoma japonicumadult worm antigen(SjAWA),and compared with detections results of sera from patients with clonorchiasis,paragonimiasis westermani,echinococciasis,hepatitis B and pulmonary tuberculosis,as well as healthy people.It showed that both of the positive rates for rSj26-Sj32 andSjAWA in detection of sera from patients with acute schistosomiasis japonica were 100%,and the specificities were 95.35%and 93.02%,respectively.Moreover,cross reactions different degrees were emerged between sera from patients with clonorchiasis,paragonimiasis westermani and alveolar echinococcosis and both of rSj26-Sj32 andSjAWA.It is suggested that the purified rSj26-Sj32 fusion portein is one of the preferable immunodiagnostic antigen for schistosomiasis japonica.

Schistosomiasis japonica;rSj26-Sj32;Dot-ELISA;immunodiagnosis

R383

A

1002-2694(2010)08-0758-04

*重慶市科委地方病重大專項基金(No.2008AB5055,2008AB5008,2008AB5054)資助

李文桂,Email:Li_wengui@yahoo.com.cn

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染病寄生蟲病研究所,重慶 400016

2010-02-23;

2010-05-17