楊進(jìn)　梅勁樺　劉震杰

[摘要] 目的 構(gòu)建紫杉醇己內(nèi)酯（CL）/碳酸亞乙酯（EC）載藥納米涂層，考察其體外釋放情況并評價其對血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞存活率的影響。 方法 結(jié)合異步降解技術(shù)和靜電紡織技術(shù)制備紫杉醇Poly（CL-co-EC）載藥納米涂層；高壓液相色譜法測定載藥體系紫杉醇包封率和體外釋放曲線；MTT實(shí)驗(yàn)測定人血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞存活率。 結(jié)果 CL/EC=6和CL/EC=9的紫杉醇Poly（CL-co-EC）的藥物包封率分別為92.1%和79.2%；載藥量分別為26.5%和18.1%；紫杉醇在體外緩慢釋放，50d后累計(jì)釋放量分別達(dá)到78%和37%。紫杉醇Poly（CL-co-EC）電紡薄膜顯著降低血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的存活率。 結(jié)論 紫杉醇Poly（CL-co-EC）載藥納米涂層具有緩慢釋放和釋放速率可控的特點(diǎn)，具有作為血管內(nèi)支架的潛在價值。

[關(guān)鍵詞] 己內(nèi)酯；碳酸亞乙酯；紫杉醇；納米涂層；血管支架

[中圖分類號] R318.08 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）01-78-04

[Abstract] Objective To establish a nano-coating of paclitaxel loaded ε-aprolactone/Ethylene carbonate copolymer and investigate the release of the nano coating and effects on inhibition ratio of vascular endothelial and smooth muscle cells. Methods The technology of asynchronous degradation and electrostatic spinning technique were used to prepare nano-drug carrier. High pressure liquid chromatography （HPLC） was used to determine the embedding ratio and release curve of paclitaxel loaded nano coating. MTT was applied to test cells survival rate. Results The embedding ratios of paclitaxel in nano-coatings of CL/EC=6 and CL/EC=9 were 92.1% and 79.2%， and drug-loading rate were 26.5% and 18.1%， respectively. Paclitaxel in nano-coatings were slow-release and the accumulative release quantities were 78% and 37% in vitro. The nano-coatings significantly reduced the survival rate of vascular endothelial and smooth muscle cells. Conclusion The nano-coatings of paclitaxel loaded ε-aprolactone/ethylene carbonate copolymer established in this study slowly releases paclitaxel and inhibits the growth of vascular endothelial and smooth muscle cells， which supplies a potential value in stent implantation.

[Key words] ε-aprolactone； Ethylene carbonate； Paclitaxel； Nano-coating； Intravascular stent

隨著膳食結(jié)構(gòu)西方化和人口老齡化問題的日益突出，心血管疾病的發(fā)生率和死亡率逐年增加[1]。介入治療是目前動脈粥樣硬化性冠心病治療的主要手段，包括經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)、動脈粥樣化切除術(shù)和血管支架植入術(shù)[2]。其中經(jīng)皮冠狀動脈成形術(shù)有30%～50%患者在術(shù)后6個月內(nèi)出現(xiàn)再狹窄或其他血管堵塞問題[3]，術(shù)后輔助支架植入可以降低血管再狹窄比例，但6個月內(nèi)再狹窄仍高達(dá)20%～30%[4]。藥物洗脫支架是通過將支架上負(fù)

載藥物定點(diǎn)釋放到狹窄部位，確保藥物對病灶療效最大化，并將對其他器官的毒副作用降到最小，問世后極大的改善了介入手術(shù)在心血管疾病治療中的效果[5-6]。

紫杉醇作為抗增殖藥被廣泛使用，它是從紅豆杉科紅豆杉屬植物中提取得到的二萜類化合物，能使細(xì)胞停留在G2/M期，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而起到抗增殖的作用[7]。研究表明紫杉醇洗脫支架可降低隱靜脈移植物病變患者術(shù)后血管再狹窄率[8]。

己內(nèi)酯和碳酸亞乙酯共聚物[Poly（CL-co-EC）]具有良好的生物相容性和理化性能[9]，并且結(jié)合電紡絲技術(shù)可以制作比用常規(guī)方法小幾個數(shù)量級的納米級纖維 [10]，易于實(shí)現(xiàn)藥物在局部的長時間停留，便于釋放靶向控制。但關(guān)于紫杉醇Poly（CL-co-EC）的建立還鮮有報(bào)道，本研究結(jié)合異步降解技術(shù)和靜電紡織技術(shù)制備紫杉醇Poly（CL-co-EC）載藥納米涂層，并通過體外實(shí)驗(yàn)評價其對原代人血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的抗增殖效果。旨在為今后研制抗內(nèi)膜增殖程序化藥物釋放血管內(nèi)支架的研制提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

己內(nèi)酯（Acros，99%）；碳酸亞乙酯（Acros，99%）；紫杉醇原料藥（純度>99%，中國桂林暉昂生化藥業(yè)有限公司）；噻唑蘭（MTT，南京建成生物工程研究所）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；RPMI-1640（Gibco公司）；高效液相色譜儀（美國Waters公司）；激光粒度儀（英國Malvern instruments公司）；酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；二氯甲烷和丙酮為分析純，乙腈和甲醇為色譜純。

1.2 載藥納米微粒的制備

1.2.1 Poly（CL-co-EC）共聚物的制備 共聚物Poly（CL-co-EC）的制備參照已發(fā)表文章[9] 中相關(guān)步驟進(jìn)行，概括如下：（1）氬氣環(huán)境下，使用Nd（DBMP）3催化合成CL/EC比例不同比例的共聚物Poly（CL-co-EC）。（2）樣品模壓制備成長×寬×高為30mm×12mm×2mm的規(guī)整板材。（3）使用靜電紡絲法制備納米級的纖維和膜材料。通過調(diào)節(jié)電壓（0 ～ 10kV）、紡絲液流速（0.1 ～ 5mL/h），制備不同納米直徑的纖維。

1.2.2 紫杉醇的包埋 對CL/EC=9的Poly （CL-co- EC）共聚物混合己二酸酐進(jìn)行電紡制備孔隙率在90%以上的電紡膜，電紡絲直徑在400～800nm。先期在生理鹽水中靜置3d，酸酐降解后進(jìn)行掃描電鏡觀察，并用DMSO溶解紫杉醇，包裹于共聚物顆粒中，顆粒直徑在100nm左右。在常溫下，將先期降解后的Poly（CL-co-EC）電紡膜置于DMSO溶液中24h。

1.3 共聚物載藥量及包封率的測定

采用高壓液相色譜法（HPLC）測定紫杉醇Poly（CL-co-EC）載藥納米涂層的載藥量，取載有紫杉醇的共聚物約2mg，精密稱定，溶于5mL乙腈中，加入蒸餾水定容至10mL，搖勻，濾過，作為樣品溶液。采用外標(biāo)一點(diǎn)法測定，外標(biāo)為紫杉醇對照品。HPLC實(shí)驗(yàn)條件：反相C18色譜柱（150.0mm×4.6mm，5m）；流動相為乙腈-水（50：50，V/V）；流速為1.0mL/min；檢測波長為227nm。

載藥量（%）=（納米粒中紫杉醇的質(zhì)量/納米粒的質(zhì)量）×100%

1.4 藥物體外釋放實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取紫杉醇加磷酸鹽緩沖溶液稀釋制成均一懸浮液，置于37℃恒溫水浴搖床中，以130r/min條件下進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)。每隔24h用等體積新鮮緩沖液更換一次釋放液，更換出的釋放液用HPLC測定紫杉醇濃度，HPLC實(shí)驗(yàn)條件同載藥量與包封率測定。計(jì)算出釋放量，繪制累積釋放曲線。

1.5 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.5.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞原代培養(yǎng) 取人體廢棄大隱靜脈10～15cm，PBS溶液洗去殘血，0.1%的粗制膠原酶消化3～10min，得到含內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，PBS溶液沖洗后離心去上清，加入RPMI 1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，在37℃、5%的二氧化碳孵育箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

取人體廢棄大隱靜脈，刮去動脈外膜和內(nèi)膜脂滴，剪成碎塊均勻鋪于培養(yǎng)瓶里，滴少許含20% FCS的DMEM濕潤培養(yǎng)瓶，后加3～5mL DMEM（含20% FCS）到培養(yǎng)瓶內(nèi)，使鋪組織塊的一面向上，置于孵育箱里，約5h后翻正，靜置培養(yǎng)1周，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.5.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率 以104/孔密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200μL，每組均設(shè)6個復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后換無血清培養(yǎng)基作用24h，使細(xì)胞同步于G0期，分別給予含有Poly（CL-co-EC）空載電紡膜或者載紫杉醇的Poly（CL-co-EC）電紡膜的相應(yīng)血清加以刺激，于共同培養(yǎng)24h、48h、72h終止，刺激結(jié)束后加5mg/mL MTT 20μL/孔，37℃，5% CO2孵育4h，小心吸棄上清，加入DMSO 150μL/孔，充分混勻，在492nm波長下測定每孔OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率

2 結(jié)果

2.3 紫杉醇Poly（CL-co-EC）電紡薄膜對血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率的影響

從圖2得出，Poly（CL-co-EC）電紡薄膜對血管內(nèi)皮細(xì)胞存活率無顯著影響，紫杉醇加載后，細(xì)胞存活率顯著下降，并隨著時間的延長細(xì)胞存活率越低。CL/EC=6的載紫杉醇電紡薄膜較CL/EC=9有更低的細(xì)胞存活率，且在72h達(dá)到差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為54%和70%）。

2.4 紫杉醇Poly（CL-co-EC）電紡薄膜對血管平滑肌細(xì)胞存活率的影響

從圖3得出，紫杉醇Poly（CL-co-EC）對血管平滑肌細(xì)胞存活率的影響與血管內(nèi)皮細(xì)胞基本一致：空載Poly（CL-co-EC）電紡薄膜組與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，電紡膜加載紫杉醇后，細(xì)胞存活率顯著下降，并隨著時間的延長細(xì)胞存活率越低，CL/EC=6與CL/EC=9的載紫杉醇電紡薄膜相比有較低的細(xì)胞存活率，72h后，兩種不同比例CL/EC載紫杉醇電紡薄膜使血管平滑肌細(xì)胞存活率分別下降到空白組的65%和76%。

3 討論

臨床上藥物洗脫支架的應(yīng)用大大改善了介入治療造成動脈粥樣硬化性冠心病的血管再狹窄問題，被稱為是介入治療的第三里程碑[5]。目前可降解合金和可降解高分子這兩大類材料在制備血管支架方面已得到大量研究?；诟叻肿硬牧系倪x擇范圍寬、力學(xué)性能更多樣，同時易于做藥物涂布，使它在支架制備中使用更加廣泛[11]。在我們前期的研究中[9]，利用Nd（DBMP）催化聚碳酸亞乙酯和己內(nèi)酯并通過改變反應(yīng)單體比例、反應(yīng)時間、加樣順序合成了一系列不同CL/EC比例的Poly（CL-co-EC）共聚物。本研究中，選擇CL/EC=9和CL/EC=6的Poly（CL-co-EC）作為紫杉醇的藥物載體。

通過HPLC檢測涂布紫杉醇的Poly（CL-co-EC）共聚物體外釋放情況，發(fā)現(xiàn)紫杉醇在50d的實(shí)驗(yàn)過程中呈緩慢釋放，到50d，CL/EC=9和CL/EC=6的紫杉醇載藥聚合物的累積釋放量分別達(dá)到37%和78%，預(yù)測紫杉醇會隨著實(shí)驗(yàn)時間的延長繼續(xù)釋放。CL/EC=6的累積釋放量更高是由于其EC含量更高，共聚物降解時間較CL/EC=9短，所以使得更多紫杉醇釋放出來。結(jié)合前期研究，可以看出通過調(diào)節(jié)CL/EC比例得到降解時間不同的Poly（CL-co-EC）高分子材料，更利于控制藥物釋放的速率。

MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率，得到包埋紫杉醇的Poly（CL-co-EC）具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞存活率的作用。研究表明紫杉醇能通過誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白聚合，并使細(xì)胞停留在G2/M期，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的死亡，被廣泛的用于抗腫瘤和抗細(xì)胞增殖[7]，但臨床常用的注射液劑型極易引起過敏等眾多嚴(yán)重不良反應(yīng)[12]，將紫杉醇包埋于高分子材料能顯著降低這些不良后果的出現(xiàn)，為紫杉醇能被更廣泛更安全地使用提供新思路。

本研究得出紫杉醇Poly（CL-co-EC）載藥納米具有緩慢釋放藥物的特點(diǎn)，并可通過調(diào)節(jié)CL/EC比例控制藥物釋放速度，具有較高的臨床應(yīng)用價值。

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（收稿日期：2014-09-09）