李敏王平 張林

1商丘師范學(xué)院體育學(xué)院（商丘 476000）

2太原科技大學(xué)體育系 3蘇州大學(xué)體育學(xué)院

肌腱在運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中具有重要作用，是肌肉收縮的第二機(jī)制。目前運(yùn)動(dòng)與肌腱的研究很活躍，但肌腱運(yùn)動(dòng)后適應(yīng)機(jī)制還不清楚。肌腱細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分為膠原，它對(duì)維持肌腱的強(qiáng)度、傳遞肌肉所產(chǎn)生的力有重要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，肌腱內(nèi)膠原合成速率要高于肌肉中膠原和肌蛋白的合成速率[1]，機(jī)械負(fù)載可以在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后水平上調(diào)控膠原的合成[2]。本實(shí)驗(yàn)從分子水平觀察長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)大鼠跟腱膠原和胰島素生長因子I（IGF-I）表達(dá)的變化，探討長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后跟腱適應(yīng)性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

3月齡健康雄性 SD大鼠 20只（218.83±15.42g），購自蘇州大學(xué)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)組，每組10只。

1.2 運(yùn)動(dòng)方案

對(duì)照組不運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行12周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，第1周周一速度為12m/min，逐漸遞增，到周五時(shí)為20m/min，每天運(yùn)動(dòng)20min；第2周時(shí)速度不變，坡度為5%，運(yùn)動(dòng)時(shí)間增至30min；第3周到第12周速度為20m/min，坡度為10%，時(shí)間為40min。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

大鼠最后一次運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)取材。對(duì)照組在運(yùn)動(dòng)組取材后第二天同一時(shí)間段取材。取材前以10%水合氯醛溶液腹腔注射（3ml/kg）麻醉大鼠。解剖后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血約3ml，放入離心管中靜置30分鐘，隨后3000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上清液裝于凍存管中，密封，置于-80℃冰箱保存待測(cè)IGF-I。大鼠取血后迅速剝離后肢跟腱，去除腱圍及相連肌肉，置于凍存管中，在液氮中速凍1小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。一側(cè)跟腱用以mRNA表達(dá)的測(cè)定，另一側(cè)跟腱稱重后真空冷凍干燥用以多肽和蛋白質(zhì)的測(cè)定。

羥脯氨酸含量的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。I型膠原的前膠原氨基末端肽（PINP）、III型膠原的前膠原氨基末端肽（PIIINP）及IGF-I含量測(cè)定采用上海西唐生物科技有限公司提供的試劑盒，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，按試劑盒說明操作。

前膠原 Iα1mRNA、IIIα1mRNA 和 IGF-I mRNA表達(dá)水平采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶反應(yīng)（real-time quantitative PCR）技術(shù)測(cè)定。用 Trizol（Invitrogen）提取跟腱總RNA。檢測(cè)濃度及純度后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Superscipt III Reverse Transcriptase，Invitrogen）在 PCR 儀（Eppendorf）中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（42℃，60min）。

基因引物序列根據(jù)Primer5.0設(shè)計(jì)，由上海英駿生物公司合成。以GAPDH為內(nèi)參照物，上游引物:5’-AGGTGACCGCATCTTCTTGTG-3’，下游引物:5'-CGTGGGTAGAGTCATACTGGAAC-3’，產(chǎn)物 大 小 為 202bp；ColIα1下游引物:5’-TCACCTACAGCACGCTTGTGG-3’，下游引物:5’-TTGGCTTTTGGGGAAATTGA-3’，產(chǎn)物大小為277bp；ColIIIα1上游引物:5’-GAACTCAAGAGCGGAGAATACTGG-3’，下游引物:5’-TGGTATGTAATGTTCTGGGAGGC-3’，產(chǎn)物大小為 302bp；IGF-I上游引物:5’-CTGGTGGACGCTCTTCAGTTC-3’，下游引物:5’-TTGGCAGGTGTTCCGATGTT-3’，產(chǎn)物大小為 380bp。使用Real-time PCR（SYBR Green I）Master Mix（TOYOBO），按試劑盒說明操作。95℃，3min預(yù)變性后，95℃ 20s，61℃20s，72℃ 30s，50 個(gè)循環(huán)。根據(jù) 2-ΔCt值計(jì)算 mRNA 表達(dá)的相對(duì)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

運(yùn)動(dòng)組跟腱重量、羥脯氨酸含量與對(duì)照組相比雖有增加趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

如表2所示，運(yùn)動(dòng)組跟腱PINP含量和前膠原Iα1mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.01）；PIIINP含量和前膠原IIIα1mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)動(dòng)組血清IGF-I含量、跟腱IGF-I含量及IGF-I mRNA表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。

表1 兩組大鼠跟腱重量和羥脯氨酸含量比較

表2 兩組大鼠跟腱膠原合成各指標(biāo)和IGF-I表達(dá)比較

3 討論

3.1 長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)跟腱重量和羥脯氨酸含量的影響

羥脯氨酸是機(jī)體膠原蛋白的主要成分之一，在正常膠原蛋白中含量約為12.5%，在各型原膠原蛋白分子中含量穩(wěn)定，固定地出現(xiàn)在膠原蛋白分子G-L-Y結(jié)構(gòu)的Y區(qū)中，而在其它蛋白則少有存在，因此，羥脯氨酸的含量可作為衡量膠原組織代謝的重要指標(biāo)。本研究中，大鼠經(jīng)過長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后跟腱重量和羥脯氨酸的含量與對(duì)照組相比雖有增加趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即總膠原含量未發(fā)生明顯變化，這表明12周長期運(yùn)動(dòng)中總膠原的合成與降解相對(duì)平衡。但未成熟小鼠進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練后[3]、雞進(jìn)行長期放養(yǎng)后[4]，其肌腱中膠原含量升高。故長期運(yùn)動(dòng)對(duì)肌腱膠原含量的影響可能與年齡及運(yùn)動(dòng)負(fù)荷有關(guān)。本研究中的大鼠經(jīng)過長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，其肌腱膠原含量未發(fā)生改變，可能是由于實(shí)驗(yàn)負(fù)荷（包括強(qiáng)度和時(shí)間）不足。

3.2 長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)膠原I和膠原III合成的影響

膠原合成過程中可溶性前膠原分泌到細(xì)胞外后，限制前膠原自我裝配的N-末端和C-末端被前膠原金屬蛋白酶切去，而后轉(zhuǎn)變成非溶性的原膠原，被切去的末端肽可特異性地反映某種類型膠原的合成[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)過長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后跟腱PINP含量和前膠原Iα1mRNA水平與對(duì)照組相比顯著增加，表明長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)不但使可溶性前膠原轉(zhuǎn)變?yōu)樵z原的過程加快，而且使跟腱中膠原I合成在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)上調(diào)。跟腱中PINP含量的變化可能受到最后一次運(yùn)動(dòng)的影響，如有研究表明一次運(yùn)動(dòng)后3天，甚至4天PICP的含量依然高于運(yùn)動(dòng)前[6]，但短時(shí)間加載肌腱前膠原Iα1mRNA水平并未發(fā)生變化[7]。這表明本研究中長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后其表達(dá)顯著增加是長期運(yùn)動(dòng)刺激的結(jié)果。此外，由于本研究中未測(cè)試跟腱膠原I含量的變化，膠原I合成的增加是否導(dǎo)致膠原I含量的增加還需要進(jìn)一步證實(shí)，但膠原I合成的增多可能會(huì)改善膠原I的質(zhì)量，如增加膠原分子之間的交聯(lián)。因此，長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后跟腱可以通過增加膠原I合成量來適應(yīng)負(fù)荷。

長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后跟腱中前膠原IIIα1mRNA表達(dá)和PIIINP含量與安靜對(duì)照組相比未發(fā)生顯著變化，表明長期運(yùn)動(dòng)后肌腱膠原III合成不再增加。肌腱中膠原III含量很少，形成的纖維較細(xì)但彈性較高，其含量增加在一定程度會(huì)降低肌腱的強(qiáng)度。膠原III合成不再增加提示長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后跟腱已對(duì)所處的力學(xué)環(huán)境產(chǎn)生了一定適應(yīng)。

3.3 長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)IGF-I的影響

研究表明IGF-I直接參與了與機(jī)械負(fù)載相關(guān)的肌腱細(xì)胞外基質(zhì)合成[8，9]。但有關(guān)IGF-I在運(yùn)動(dòng)后肌腱適應(yīng)中的作用還不清楚。本研究中長期耐力跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)組大鼠血清IGF-I含量與對(duì)照組相比顯著增加，表明長期運(yùn)動(dòng)可提高依賴于垂體GH途徑的IGF-I合成。IGF-I作為一種多肽生長因子，可通過自分泌和旁分泌的方式作用于自身和其它細(xì)胞，循環(huán)系統(tǒng)中IGF-I含量的增加可增強(qiáng)其對(duì)全身組織的生物學(xué)效應(yīng)。

本研究中，長期運(yùn)動(dòng)后大鼠跟腱內(nèi)IGF-I在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均顯著高于對(duì)照組，表明長期運(yùn)動(dòng)可上調(diào)跟腱內(nèi)源性IGF-I合成。長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后跟腱內(nèi)IGF-I表達(dá)增加與前述膠原I表達(dá)增高一致，這表明長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后IGF-I在肌腱細(xì)胞外基質(zhì)的代謝適應(yīng)中具有一定的作用。運(yùn)動(dòng)對(duì)局部組織刺激增加，經(jīng)不依賴于垂體GH的途徑，即局部機(jī)械刺激的作用上調(diào)IGF-I的合成。長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后IGF-I表達(dá)與膠原I合成的一致性，表明IGF-I在長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后的跟腱適應(yīng)中具有一定作用。

研究表明，運(yùn)動(dòng)可使局部跟腱組織血流量增加[10，11]，從而增強(qiáng)長期運(yùn)動(dòng)的系統(tǒng)效應(yīng)對(duì)局部組織的影響，即長期耐力跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，不但內(nèi)源性IGF-I合成增加影響了跟腱的代謝，循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)IGF-I也增加，從而增加組織損傷修復(fù)的潛能[12，13]。

4 小結(jié)

長期耐力跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后跟腱改變的是膠原質(zhì)量而非數(shù)量，跟腱通過提高跟腱膠原I的合成來適應(yīng)負(fù)荷。血清和跟腱IGF-I的提高表明其在跟腱對(duì)長期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)中具有一定作用。

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