汪進(jìn)良，焦順昌，胡 毅，李瑾昱

解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，北京100853

肺癌是當(dāng)前人類最常見的惡性腫瘤之一，為腫瘤死亡的首要病因。肺癌的治療除少數(shù)早期患者可手術(shù)切除外，絕大多數(shù)的晚期患者仍是以化療和放療為主，但總的5年生存率不到15%。由于60%以上的肺癌組織中存在p53基因突變，因而針對p53突變的基因治療成為了研究熱點(diǎn)?；A(chǔ)及臨床研究表明，以腺病毒為載體，與人野生型p53cDNA重組構(gòu)建的重組人p53腺病毒 (recombinant human adenovirus p53，rAd-p53)可有效抑制腫瘤生長，同時，rAd-p53可與化療藥物聯(lián)合使用，增加腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感性［1］。另有研究表明，當(dāng)rAd-p53與順鉑 (cisplatin，DDP)聯(lián)合時，可明顯增加DDP對肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用，其機(jī)制與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)［2］。本研究通過基因芯片的方法，從基因水平探討rAd-p53提高DDP對肺腺癌A549細(xì)胞抑制作用的機(jī)制，以期為rAd-p53和化療的聯(lián)合應(yīng)用提供依據(jù)。

材料和方法

材料人肺腺癌A549細(xì)胞由我科胡毅博士取自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。重組人p53腺病毒注射液 (今又生)由深圳市賽百諾基因技術(shù)有限公司提供，批號:20070501。順鉑注射液由江蘇豪森藥液股份有限公司提供，批號:070203。胰蛋白酶-EDTA消化液為美國Amresco公司產(chǎn)品，胎牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品，RPMI-1640培養(yǎng)基為美國invitrogen公司產(chǎn)品。人腫瘤相關(guān)基因芯片由北京博奧生物公司提供。RNA Clean-up試劑盒和PCR Nucleo-Spin ExtractⅡ試劑盒為德國MACHEREY-NAGEL公司產(chǎn)品;dNTPs和 RQ1 RNase-Free DNase為美國 Promega公司產(chǎn)品;Cy5-dCTP和Cy3-dCTP購自美國 GE Healthcare集團(tuán);DL2000 marker為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。所有引物均由Invitrogen公司合成。

樣品制備肺腺癌A549細(xì)胞按25×104細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，待完全貼壁后，所有6孔細(xì)胞均給予0.1 mg/ml DDP，100 μl/孔。另外，其中3孔細(xì)胞給予LacZ空載病毒，標(biāo)記為A1、A2、A3;另3孔給予感染強(qiáng)度為125 PFU/細(xì)胞的rAd-p53，標(biāo)記為B1、B2、B3。加藥2 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)46 h后抽提細(xì)胞總RNA，具體操作步驟嚴(yán)格按Trizol試劑說明書進(jìn)行。紫外吸收法測定樣品RNA濃度和純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。提取的總RNA樣品A1、A2、A3合并為對照組A，樣品B1、B2、B3合并為實(shí)驗(yàn)組B。

樣品RNA熒光標(biāo)記以總RNA起始，含有T7啟動子序列的T7 Oligo(dT)Primer為引物，使用CbcScript酶合成1st-strand cDNA;再用RNA酶H將雜合鏈中的RNA切成短片段，DNA多聚酶以RNA短片段為引物延伸，合成2nd-strand cDNA，并純化雙鏈cDNA;以cDNA為模板，利用T7 Enzyme Mix合成cRNA，然后用RNA Clean-up試劑盒純化;取2 μg cRNA，用CbcScriptⅡ酶，隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用PCR NucleoSpin ExtractⅡ試劑盒純化;以隨機(jī)引物對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行KLENOW酶標(biāo)記，標(biāo)記產(chǎn)物用PCR NucleoSpin ExtractⅡ試劑盒純化，純化后抽干。

雜交、清洗、芯片掃描和數(shù)據(jù)分析標(biāo)記的DNA溶于80 μl雜交液中 (3×SSC，0.2%SDS，5×Denhart's，25%甲酰胺)，于42℃雜交過夜。雜交結(jié)束后，先在42℃含0.2%SDS，2×SSC的液體中洗5 min，然后在0.2×SSC中室溫洗5 min。玻片甩干后用LuxScan 10KA雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描。對照組樣品A以cy5用紅色表示，實(shí)驗(yàn)組樣品B以cy3用綠色表示。對于某一點(diǎn)的信號來講，如果cy3信號較強(qiáng)，該點(diǎn)多顯綠色;如果cy5信號較強(qiáng)，該點(diǎn)多顯紅色;如果強(qiáng)度相似，即顯黃色。采用LuxScan 3.0圖像分析軟件對芯片圖像進(jìn)行分析，以灰度值比值相差2倍以上作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SAM軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

實(shí)時熒光定量PCR對基因芯片結(jié)果的驗(yàn)證為驗(yàn)證芯片結(jié)果，挑選2個表達(dá)上調(diào)基因TP53和TNFRSF6以及1個表達(dá)下調(diào)基因ABCC4做實(shí)時熒光定量PCR，以GAPDH作為內(nèi)參。各基因的引物序列為:TP53:上游引物ACCACCATCCACTACAACTACAT，下游引物 ACAAACACGCACCTCAAAGC;TNFRSF6:上游引物 CGAAAATGTTCAATAATGTCCC，下游引物TTCTTTAGGTGGTTCCAGGTAT;ABCC4:上游引物 GCCAAACCTCTAACCGACAT，下游引物TTCAATACAGCCCAAACCAA;GAPDH:上游引物TGTTGCCATCAATGACCCCTT，下 游 引 物 CTCCACGACGTACTCAGCG。按試劑說明和儀器操作規(guī)程將樣品總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行實(shí)時PCR反應(yīng)，利用儀器所配的軟件計(jì)算各張PCR芯片中的每個基因的Ct(C代表循環(huán)數(shù)、t代表域值，指熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))值。最后，采用△△Ct方法比較相應(yīng)基因的表達(dá)量變化，并與基因芯片結(jié)果進(jìn)行對比。

結(jié) 果

細(xì)胞總RNA提取質(zhì)量鑒定結(jié)果經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測，DDP處理的對照組A549細(xì)胞提取的3份樣品A1、A2、A3總RNA和DDP聯(lián)合rAd-p53作用后提取的3份樣品 B1、B2、B3總 RNA的 A260/280值為1.8～1.9，A260/230值為1.5～1.9，即總RNA的純度較高，無明顯蛋白質(zhì)及其他鹽分摻雜。瓊脂糖凝膠電泳檢測可見RNA電泳條帶清晰，28S與18S rRNA條帶亮度接近2:1。因此，總RNA可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

基因芯片掃描結(jié)果rAd-p53聯(lián)合DDP與單獨(dú)DDP處理的A549細(xì)胞的基因表達(dá)情況進(jìn)行比較，43個基因表達(dá)差異2倍以上，其中15個基因表達(dá)顯著上調(diào)，28個基因表達(dá)顯著下調(diào) (圖1，表1、2)。

實(shí)時熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果對照組A和實(shí)驗(yàn)組B樣品的TP53、TNRSF6、ABCC4基因和作為內(nèi)參的GAPDH基因分別進(jìn)行實(shí)時PCR反應(yīng)。實(shí)時熒光定量PCR時各樣品上樣量均為10μl，由于受RNA濃度定量誤差和RNA逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響，每個樣品的10μl體積的cDNA含量并不完全相同，為校正此差異，使用GAPDH基因作為內(nèi)參，以各基因的差異比除內(nèi)參值，對各基因的差異比進(jìn)行歸一化。計(jì)算得到TP53、TNRSF6、ABCC4基因歸一化后的差異比分別為13.26、2.20和0.64，基因芯片各基因的差異比分別為6.89、2.35和0.66。兩個結(jié)果完全一致，TP53和TNRSF6基因表達(dá)上調(diào)而ABCC4基因表達(dá)下調(diào)。

討 論

p53基因是重要的腫瘤抑制基因，編碼的P53蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面均具有關(guān)鍵性作用，因而被譽(yù)為“基因組保護(hù)神”。許多研究表明，P53能夠影響多種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制生長、激活或抑制某些信號通路和抑制血管新生等［3］。既往研究證實(shí)rAd-p53聯(lián)合DDP顯著提高對腫瘤細(xì)胞的抑制率［2］，本研究采用功能分類基因芯片的方法進(jìn)一步明確該作用的機(jī)制，本研究選用的人腫瘤相關(guān)基因芯片為寡核苷酸芯片，包含2 747個腫瘤相關(guān)基因的4 854個轉(zhuǎn)錄本，芯片上以4個人的看家基因GAPDH、ACTB、LDHA、RPS9作為陽性對照，點(diǎn)樣溶液作為陰性對照。除了在芯片設(shè)計(jì)中采取質(zhì)控措施外，還采用實(shí)時PCR的方法驗(yàn)證了基因芯片數(shù)據(jù)的可靠性。

本研究將rAd-p53聯(lián)合DDP與單獨(dú)DDP處理的A549細(xì)胞的基因表達(dá)情況進(jìn)行比較，結(jié)果顯示43個基因的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，包括CDKN1A(即p21)、 CCND1、 FAS、 TNFSF14、 BAK1、 TP53I3、MAD2L1、BTG2、EMP1、EDNRB、MDM2基因等。這些基因的功能涉及到細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞增殖等細(xì)胞生命活動的各個方面。

表1 表達(dá)上調(diào)基因Table 1 Up-regulation genes

表2 表達(dá)下調(diào)基因Table 2 Down-regulation genes

rAd-p53干預(yù)后CDKN1A即p21基因表達(dá)上調(diào)。p21基因是p53的下游基因之一，一方面p21與細(xì)胞周期蛋白E/CDK2復(fù)合物結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞的G1期阻滯，還與細(xì)胞周期蛋白A/CDK2結(jié)合而阻滯細(xì)胞于G2/M期;另一方面，p21還可與細(xì)胞增殖的速發(fā)早期基因增殖細(xì)胞核抗原、c-fos等結(jié)合阻斷DNA復(fù)制，抑制細(xì)胞增殖［4］。CCND1基因編碼的細(xì)胞周期蛋白D1蛋白過度表達(dá)可使細(xì)胞G1期縮短，細(xì)胞分裂速度加快而出現(xiàn)過度增殖。文獻(xiàn)報(bào)道人體多種惡性腫瘤都有細(xì)胞周期蛋白Dl過表達(dá)，包括頭頸部鱗癌、肝細(xì)胞癌及非小細(xì)胞肺癌等［5-6］。本研究CCND1基因表達(dá)下調(diào)可能與P53調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖有關(guān)。

細(xì)胞DNA損傷后，p53首先誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和DNA修復(fù)。如果損傷不能被修復(fù)，p53基因就通過下調(diào)抑制凋亡基因和上調(diào)促凋亡基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究rAd-p53導(dǎo)入后上調(diào)了FAS、TNFSF14、BAK1和TP53I3基因的表達(dá)，可能與p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。FAS基因即TNFRSF6，屬于TNF受體超家族成員。Fas與它的天然配體FasL結(jié)合是Fas在體內(nèi)發(fā)揮作用的唯一途徑，也是細(xì)胞凋亡中最主要的途徑之一［7］。Fas與FasL結(jié)合可激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶半胱天冬酶家族的一系列酶聯(lián)反應(yīng)，引起DNA降解和鏡下可見的細(xì)胞及細(xì)胞核的凋亡形態(tài)學(xué)改變。TNFSF14基因編碼的蛋白是TNF超家族 (TNFSF)第14個成員，具有促進(jìn)細(xì)胞生長、分化或死亡的功能。Fan等［8］研究表明，NK細(xì)胞表面可表達(dá)TNFSF14的受體HVEM，TNFSF14與HVEM結(jié)合可促進(jìn)NK細(xì)胞的激活、分化和IFN-γ的分泌。而NFSF14和IFN-γ協(xié)同可將Bcl-2從抗凋亡轉(zhuǎn)為親凋亡的形式，促進(jìn)凋亡［9］。BAK1基因編碼的蛋白質(zhì)屬于BCL-2蛋白家族，參與細(xì)胞凋亡的調(diào)變，是凋亡過程中一種重要的調(diào)節(jié)因子。TP53I3被p53誘導(dǎo)，參與p53介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，編碼的蛋白質(zhì)是醌氧化還原酶的同源類似物，與細(xì)胞對氧化和照射應(yīng)激有關(guān)，參與細(xì)胞活性氧物質(zhì)的代謝，可能通過調(diào)控活性氧參與細(xì)胞凋亡。

P53引起的MAD2L1和BTG2基因表達(dá)下調(diào)也可抑制細(xì)胞增殖。MAD2L1基因編碼的蛋白是細(xì)胞內(nèi)的著絲粒相關(guān)蛋白—檢查點(diǎn)蛋白的重要組成成分，在細(xì)胞分裂監(jiān)控中具有關(guān)鍵作用［10-11］。MAD2基因的正常表達(dá)是保證細(xì)胞染色體正常分離的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［12］。MAD2基因表達(dá)下降，可能導(dǎo)致部分染色體分離遲滯，甚至可能導(dǎo)致細(xì)胞分裂減緩或停止，使細(xì)胞增殖抑制［13-14］。BTG2基因是抗增殖基因家族中的一個新成員，是細(xì)胞生長的“監(jiān)控器”。BTG2既可抑制周期素D1轉(zhuǎn)錄而降低其表達(dá)的蛋白水平，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期［15］，還可阻止周期素B1和CDC2的結(jié)合抑制CDC2激酶活性發(fā)揮作用，誘導(dǎo)細(xì)胞 G2 期的停滯［16］。

rAd-p53導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞后，p53基因表達(dá)顯著上調(diào)，MDM2基因表達(dá)也顯著增加。MDM2是p53基因的靶基因，編碼核磷酸蛋白，主要通過與p53結(jié)合，形成p53-MDM2反饋環(huán)。p53基因表達(dá)上調(diào)后，誘導(dǎo)MDM2基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)致使細(xì)胞中MDM2水平升高，并與p53結(jié)合形成復(fù)合物，從而抑制p53的轉(zhuǎn)錄激活。由于MDM2對p53的誘導(dǎo)凋亡和腫瘤抑制具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，提示可以在導(dǎo)入p53基因的同時，對MDM2的表達(dá)給予抑制，可能會進(jìn)一步提高p53的抑瘤效果。

綜上，rAd-p53作為基因治療藥物，導(dǎo)入并上調(diào)p53基因表達(dá)后，通過改變包括細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等一系列基因的表達(dá)，引起細(xì)胞周期阻滯、增殖抑制和凋亡增加，從而提高DDP對腫瘤的敏感性和殺傷效率。如果導(dǎo)入多個基因 (如p53協(xié)同基因)或抑制部分基因表達(dá) (如MDM2基因)，可能進(jìn)一步增加抑瘤效率。另外，p53基因表達(dá)上調(diào)后，還有一些基因的表達(dá)變化是腫瘤細(xì)胞生長抑制后造成，還是p53基因直接作用的結(jié)果，尚不十分清楚。同時，由于本研究只是在基因水平通過寡核苷酸芯片的方法對rAd-p53作用后腫瘤細(xì)胞中相關(guān)基因表達(dá)變化進(jìn)行初步篩選，缺少重復(fù)和蛋白質(zhì)水平的進(jìn)一步驗(yàn)證，因此，尚需要結(jié)合其他方法以及體內(nèi)研究進(jìn)一步證實(shí)。

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圖1 芯片雜交的偽色圖Fig 1 Pseudo-color map of gene chip hybridization