張丙云，袁亞蘭，高瑜璟，蘇雪艷，任海偉

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050）

蕓豆蛋白的營養(yǎng)價(jià)值和功能特性研究

張丙云，袁亞蘭，高瑜璟，蘇雪艷，任海偉*

（蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050）

以蕓豆蛋白（KBP）為研究對(duì)象，采用比值系數(shù)法和模糊識(shí)別法全面評(píng)價(jià)其營養(yǎng)價(jià)值。結(jié)果表明，蕓豆蛋白的必需氨基酸組成符合FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)模式，其氨基酸評(píng)分（AAS）、化學(xué)評(píng)分（CS）、必需氨基酸指數(shù)（EAAI）、生物價(jià)（BV）、營養(yǎng)指數(shù)（NI）和氨基酸比值系數(shù)分（SRCAA）分別為91.25、67.59、78.07、43.54、74.55和62.38。對(duì)蕓豆蛋白的溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性和起泡穩(wěn)定性等功能特性進(jìn)行初步測定，結(jié)果表明其功能特性良好。SDS-PAGE分析表明蛋白組分的相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在8條帶上，分別對(duì)應(yīng)為90.5、81.3、65.8、43.9、41.5、33.7、30.2、17.5kDa。

蕓豆蛋白，營養(yǎng)評(píng)價(jià)，功能特性，SDS-PAGE，傅里葉變換紅外光譜

蕓豆（Phaseolus vulgaris Linn.sp）學(xué)名菜豆，是普通菜豆（如小黑蕓豆、小白蕓豆等）和多花菜豆（如圓奶華蕓豆 H、N、D、X等）之總稱，屬豆科（Leguminosae）菜豆屬（Phaseolus L.）的小宗雜糧作物。蕓豆具有極高的營養(yǎng)和藥用價(jià)值，蛋白含量20.29%～27.73%，脂肪含量1.02%～2.03%，維生素C含量1.88～1.96mg/100g，維生素B1含量3.52mg/100g，維生素B2含量2.87mg/100g，Ca、Fe含量分別是雞肉的7倍和4倍［1］。中醫(yī)理論記載，蕓豆味甘平，性溫，具有溫中下氣、利腸胃、止呃逆、益腎補(bǔ)元?dú)獾裙πА，F(xiàn)代研究表明，蕓豆還含有花色苷、皂苷等有效成分，能提高人體非特異性免疫，增強(qiáng)抗病能力，激活淋巴T細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)展，受到醫(yī)學(xué)界的廣泛重視［2］。本研究以產(chǎn)自甘肅臨夏的涇川白蕓豆為材料，以蕓豆蛋白為研究對(duì)象，從蛋白組成成分、營養(yǎng)價(jià)值、相對(duì)分子質(zhì)量及功能特性等方面進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期為蕓豆等雜糧作物的開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

涇川白蕓豆 蛋白質(zhì)含量22.47%，脂肪含量2.56%，采自甘肅臨夏；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)maker 肌球蛋白 200kDa，半乳糖苷酶 116kDa，磷酸酶97.2kDa，牛血清蛋白66.4kDa，卵清蛋白44.3kDa，大連寶生物有限公司。

TGL-16高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)公司；DYY-2C型電泳儀、DYJ-28A型垂直板電泳槽 BIO -RAlaboratories-seriates（Milan）Italy；FD-1-55冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；835-50氨基酸自動(dòng)分析儀 日本Hitachi公司；FT-IR380傅里葉紅外光譜儀 配有 DTGS/KBr檢測器，美國 Nicolet公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蕓豆蛋白的分離制備 采用堿溶酸沉法［3］。

1.2.2 蛋白主要理化指標(biāo)分析 水分的測定參照GB/T5009.3-2003；灰分的測定參照 GB/T5009.4-2003；粗脂肪的測定參照GB/T14772-2008；總蛋白含量的測定參照GB/T5009.5-2003。

1.2.3 7s和11s球蛋白的超速離心分析 參考文獻(xiàn)

［4］中采用的改良Nagano法。

1.2.4 蛋白氨基酸組成分析 準(zhǔn)確稱取研細(xì)的待測樣品0.5g，裝于10mL水解管中，加入8mL 6mol/L的鹽酸，真空泵抽至真空后充入高純氮?dú)?，重?fù)3次，用酒精噴燈封管，110℃水解24h。取出，打開水解管，轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中并用水稀釋至刻度，過濾，取濾液10mL于蒸餾燒瓶中55℃水浴蒸發(fā)至干，加樣品稀釋液10mL，超聲溶解后過0.45μm膜，置于2mL進(jìn)樣瓶中供儀器測定用。用堿水解法測定色氨酸。

1.2.5 蛋白營養(yǎng)價(jià)值的評(píng)價(jià)

1.2.5.1 比值系數(shù)法 以FAO/WHO推薦的必需氨基酸模式和雞蛋氨基酸模式作參比，計(jì)算氨基酸評(píng)分（AAS）、化學(xué)評(píng)分（CS）、氨基酸比值系數(shù)（RC）、必需氨基酸比率（A/E）、必需氨基酸指數(shù)（EAAI）、氨基酸比值系數(shù)分（SRCAA）、生物價(jià)（BV）和營養(yǎng)指數(shù)（NI）［4-5］。

1.2.5.2 模糊識(shí)別法 參考文獻(xiàn)［6］中蘭氏距離法計(jì)算蕓豆蛋白與標(biāo)準(zhǔn)蛋白α的貼近度。

1.2.6 蕓豆分離蛋白功能性質(zhì)的研究

1.2.6.1 溶解性 稱取一定量的蛋白樣品，用25mL PBS緩沖溶液制備成不同pH梯度的蛋白分散系，室溫下攪拌1h，在3000r/min離心20min，用半微量凱氏定氮法測定上清液中蛋白質(zhì)含量。重復(fù)測定3次。

1.2.6.2 起泡性和起泡穩(wěn)定性 起泡性：稱取一定量蛋白樣品溶解到100mL蒸餾水（pH7.0）中，在3000r/min條件下室溫均質(zhì)5min，測定攪拌停止30s時(shí)的體積，重復(fù)測定3次。體積的增加量與原來體積的百分比值表示為起泡能力。起泡穩(wěn)定性：靜置30min后的泡沫體積與攪拌停止30s時(shí)體積的百分比值表示起泡穩(wěn)定性。

1.2.6.3 乳化性及乳化穩(wěn)定性 乳化性：稱取一定量蛋白樣品溶于100mL蒸餾水（pH7.0）中，取其中30mL加入花生色拉油10mL，在12000r/min條件下室溫均質(zhì)2min，分別在0、5、10、15、20、25、30min取樣。用pH7.0、0.1%SDS溶液稀釋50倍，500nm處測定吸光度，SDS溶液作空白。重復(fù)測定3次。以0時(shí)刻的吸光值乘以稀釋倍數(shù)表示乳化性（EA）。乳化穩(wěn)定性：繪制吸光度隨時(shí)間變化的關(guān)系曲線，以降到零時(shí)刻50%吸光值的時(shí)間表示乳化穩(wěn)定性。

1.2.7 電泳分析 蕓豆蛋白組分的相對(duì)分子質(zhì)量測定采用SDS-PAGE法。濃縮膠5%濃度，分離膠10%濃度。蛋白樣品（1～2mg/mL）溶于0.025mol/L pH8.3Tris-Gly緩沖液中，每孔加20μL樣品進(jìn)行電泳，電泳恒壓 120V進(jìn)行，濃縮膠 10mA，分離膠20mA。

1.2.8 FT-IR結(jié)構(gòu)表征 蕓豆蛋白的紅外光譜結(jié)構(gòu)表征采用溴化鉀壓片法［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕓豆蛋白的組分分析

經(jīng)測定，以干基計(jì)蕓豆蛋白的蛋白質(zhì)含量為95.48%，脂肪和灰分含量較低，說明提取的蛋白純度較高。根據(jù)離心沉降法分析蕓豆蛋白組分可知，7s和11s球蛋白含量分別為4.61%和10.22%。這與孫鑫［8］報(bào)道的蕓豆蛋白主要成分為不含二硫鍵的7S球蛋白有所不同，原因可能是蕓豆品種差異所致，文獻(xiàn)中所用原料為東北紅蕓豆，而本實(shí)驗(yàn)中原料為涇川白蕓豆。

2.2 氨基酸分析與營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

2.2.1 氨基酸組成分析 蕓豆蛋白中共含有18種氨基酸（見表1），氨基酸總量達(dá)85.30%，其中谷氨酸含量最高（13.69%），其次是天門冬氨酸（10.13%）。谷氨酸在人體內(nèi)可促進(jìn)氮基丁酸的合成，從而降低血氨，促進(jìn)腦細(xì)胞呼吸，可以用于治療神經(jīng)精神疾病，如精神分裂癥和腦血管障礙等引起的記憶和語言障礙、小兒智力不全等。天門冬氨酸是一種良好的營養(yǎng)增補(bǔ)劑，可用于治療心臟病、肝臟病、高血壓癥，具有防止和恢復(fù)疲勞的作用［9］。由表1還可知，蛋白中人體必需的8種氨基酸含量為35.32%，必需氨基酸占總氨基酸的比值（EAA/TAA）為41.41%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值（EAA/NEAA）為70.62%。這與FAO/WHO提出的EAA/TAA比值為40%左右，EAA/NEAA為60%以上的參考蛋白模式相近，說明蕓豆蛋白屬于優(yōu)質(zhì)蛋白。

2.2.2 營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià) 一種營養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白質(zhì)，不僅必需氨基酸種類要齊全，而且比例也要適宜，最好能與人體需要相符合，這樣氨基酸才能吸收完全。由表2可知，蕓豆蛋白中必需氨基酸各自占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，除異亮氨酸、亮氨酸和蘇氨酸略低于模式譜外，其它均高于WFO/FAO標(biāo)準(zhǔn)模式，必需氨基酸評(píng)分為91.25，與標(biāo)準(zhǔn)模式接近，可見蕓豆蛋白必需氨基酸比例均衡，有很高的營養(yǎng)價(jià)值。從蛋白的RC可以看出，異亮氨酸、蘇氨酸和亮氨酸的RC＜1，其余氨基酸均大于1，說明異亮氨酸和蘇氨酸含量偏少，分別為第一和第二限制性氨基酸。

現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)更多強(qiáng)調(diào)蛋白質(zhì)的氨基酸平衡，氨基酸不足或過剩同樣嚴(yán)重影響蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值。氨基酸比值系數(shù)分（SRCAA）就是從各種必需氨基酸偏離氨基酸模式的離散度這個(gè)角度來評(píng)價(jià)其質(zhì)量。SRCAA越接近100，其氨基酸組成與FAO/WHO模式越一致。同樣，貼近度（μ）值反映了被評(píng)價(jià)蛋白的質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的接近程度。μ值越接近1，其蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值相對(duì)越高。營養(yǎng)指數(shù)（NI）綜合衡量蛋白質(zhì)的含量與其氨基酸組成，蛋白質(zhì)的百分含量越高，EAAI值越大，NI值就越高，營養(yǎng)價(jià)值就高。由表3可知，蕓豆蛋白的AAS、CS、EAAI和NI值均高于大豆蛋白和乳清蛋白，只有SRCAA和BV略低。另外，蕓豆蛋白的貼近度為0.92，與大豆和牛奶貼近度值相近［10-11］。盡管不同的評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行營養(yǎng)評(píng)價(jià)，結(jié)果會(huì)有所差異，但綜合各種指標(biāo)充分說明了蕓豆蛋白可以作為一種良好的優(yōu)質(zhì)植物蛋白源。

2.3 蕓豆蛋白的功能特性

2.3.1 溶解性 本實(shí)驗(yàn)主要研究pH對(duì)溶解度的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖可知，蕓豆蛋白在pH4.0附近溶解度最低，這主要是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是一種同時(shí)帶有正負(fù)電荷的化合物，在其等電點(diǎn)pH4.0處缺乏靜電推斥作用，疏水相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集和沉淀。同時(shí)，蕓豆蛋白中Asp和Glu含量大于Lys、Arg和His含量，即酸性氨基酸的殘基總和較大。另外，由于二、三級(jí)空間結(jié)構(gòu)組成的蛋白質(zhì)構(gòu)象是脆弱的，pH變化能引起蛋白質(zhì)構(gòu)象不同程度的改變。具體而言，在低于或高于等電點(diǎn)pH4.0時(shí)，蛋白質(zhì)分別帶有凈的正電荷和凈的負(fù)電荷，帶電氨基酸殘基的靜電推斥和水合作用促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶解。這與周大寨等［2］報(bào)道的蕓豆蛋白等電點(diǎn)為 pH4.7研究結(jié)果相近。

表1 蕓豆蛋白氨基酸成分分析（g/100g，以干基計(jì)）

表2 蕓豆蛋白的各種營養(yǎng)評(píng)價(jià)指標(biāo)

表3 蕓豆蛋白與大豆蛋白和乳清蛋白營養(yǎng)指標(biāo)比較

圖1 蕓豆蛋白不同pH下的溶解性

2.3.2 起泡性和泡沫穩(wěn)定性 蕓豆蛋白含有疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)，因而具有表面活性，能降低水的表面張力，在劇烈攪拌時(shí)可形成泡沫。從圖2可以看出，蛋白濃度4%時(shí)，起泡性達(dá)到最大，蛋白濃度在1%～4%之間時(shí)，起泡性隨蛋白濃度的增加而增大，這可能是因?yàn)楦叩鞍诐舛忍岣吡损ざ?，有助于在界面形成多層的黏合蛋白質(zhì)膜。而當(dāng)濃度繼續(xù)增加時(shí)，起泡性隨蛋白濃度的增加而有所減小。由圖還可知，隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，泡沫穩(wěn)定性呈上升的趨勢，在1%～4%之間增幅較大，之后上升趨勢比較平緩。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)濃度較大時(shí)，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用導(dǎo)致形成較厚的吸附膜，對(duì)泡沫的穩(wěn)定性是有益的。

圖2 蛋白濃度與起泡性和泡沫穩(wěn)定性的關(guān)系

2.3.3 乳化性和乳化穩(wěn)定性 相同條件下不同濃度蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性結(jié)果見圖3。由圖可知，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度達(dá)4%時(shí)，乳化性和乳化穩(wěn)定性增加趨勢減緩；同時(shí)在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，乳化能力及其穩(wěn)定性均隨蛋白濃度的增加而增大，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在界面上的吸附特點(diǎn)為分級(jí)吸附，隨著蛋白質(zhì)濃度的增加，單分子吸附層變?yōu)槎喾肿游綄?，繼而形成排列更加緊密的有一定強(qiáng)度的界面膜，使得乳化能力和乳化穩(wěn)定性增加。

2.4 電泳分析

圖3 蛋白濃度與乳化性和乳化穩(wěn)定性的關(guān)系

圖4為蕓豆蛋白和7s球蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（lgMw）對(duì)其相對(duì)遷移率（Rf）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：lgMw=-0.683Rf+3.8945，相關(guān)系數(shù) R2=0.9918。分析可知，蕓豆蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布均在97.2kDa以下，主要集中在8條帶上，從大到小分別對(duì)應(yīng)為90.5、81.3、65.8、43.9、41.5、33.7、30.2、17.5kDa左右，其中65.8kDa和41.5kDa對(duì)應(yīng)的兩條蛋白組分譜帶強(qiáng)度較亮，推斷可能其含量較高，但各相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)應(yīng)的蛋白組分百分含量比還需要進(jìn)一步分析研究。

圖4 蕓豆蛋白SDS-PAGE電泳圖譜

圖5 蕓豆活性蛋白FT-IR光譜圖

2.5 FT-IR結(jié)構(gòu)表征

蕓豆蛋白的FT-IR圖譜如圖5所示。由圖可知，3200～3500cm-1之間3421.11cm-1的強(qiáng)吸收歸屬于酰胺A帶的N-H伸縮（氫鍵）振動(dòng)峰，2928.68cm-1和2960.25cm-1附近的弱吸收峰為酰胺B帶的C-H（-CH2或-CH3）伸縮振動(dòng)。1643.57cm-1處的較強(qiáng)吸收為酰胺Ⅰ帶羰基C=O伸縮振動(dòng)吸收峰，1539.52cm-1處為酰胺Ⅱ帶N-H彎曲振動(dòng)吸收峰，酰胺Ⅰ和Ⅱ帶是蛋白質(zhì)的特征吸收峰。此外，1454.09cm-1的微弱吸收代表C-H的彎曲振動(dòng)峰，1238.41cm-1為酰胺Ⅲ帶的N-H變形峰。從蛋白微觀結(jié)構(gòu)看，主要根據(jù)酰胺Ⅰ帶（1700～1600cm-1）來歸屬蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中1624～1642cm-1為β-轉(zhuǎn)角，1650±1.0cm-1處為無規(guī)卷曲，1656±2.0cm-1處為α-螺旋，1666～1688cm-1處為轉(zhuǎn)角。由1643.57cm-1處的較強(qiáng)吸收峰可以推斷蕓豆蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)為主。

3 結(jié)論

蕓豆蛋白的氨基酸種類齊全，必需氨基酸組成符合FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)模式，其氨基酸評(píng)分（AAS）、化學(xué)評(píng)分（CS）、必需氨基酸指數(shù)（EAAI）、生物價(jià)（BV）、營養(yǎng)指數(shù)（NI）和氨基酸比值系數(shù)分（SRCAA）分別為91.25、67.59、78.07、43.54、74.55和62.38。功能特性的初步研究表明，蕓豆蛋白具有良好的起泡性和乳化能力等功能特性。SDS-PAGE分析表明蕓豆蛋白不同組分對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在8條帶上，分別對(duì)應(yīng)為90.5、81.3、65.8、43.9、41.5、33.7、30.2、17.5kDa。通過對(duì)蕓豆蛋白進(jìn)行全面的營養(yǎng)評(píng)價(jià)和初步的功能特性研究，發(fā)現(xiàn)蕓豆蛋白具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值，可以作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源開發(fā)利用。

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Study on nutritional assessment and functional properties of kidney bean protein

ZHANG Bing-yun，YUAN Ya-lan，GAO Yu-jing，SU Xue-yan，REN Hai-wei*
（College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China）

Taking kidney bean protein（KBP）as material，the method on fuzzy discernment and ratio coefficient was applid to general nutrition assessment of KBP.Results showed that the proportion between essential amino acids（EAAs）was suitable and conformed to recommended reference pattern of FAO/WHO.The amino acid score（AAS），chemical score（CS），essential amino acid index（EAAl），biological value（BV），nutrition index（Nl）and score of ratio coeficient of amino acid（SRCAA）of KBP were 91.25，67.59，78.07，43.54，74.55 and 62.38，respectively. ln conclusion，the protein nutrient value of KBP was very high.Moreover，the functional properties of KBP such as solubility，foam ability，foam stability，emulsifying property and emulsion stability were also discussed in the present study.SDS-PAGE analysis indicated that the relative molecular weights of different protein components were 90.5，81.3，65.8，43.9，41.5，33.7，30.2，17.5kDa，respectively.

kidney bean protein（KBP）；nutrition valuation；functional properties；SDS-PAGE；FT-lR

TS201.2+1

A

1002-0306（2010）11-0347-04

2009-12-01 *通訊聯(lián)系人

張丙云（1968-），女，副教授，研究方向：食品科學(xué)。

2009年國家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目。