馬燕燕，魯曉翔

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

龍井乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用

馬燕燕，魯曉翔*

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

以龍井、柿葉、貢菊和銀杏葉為原料，用L-酪氨酸和L-DOPA為底物測(cè)定各原料的乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用。結(jié)果表明，四種原料的乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶均有一定的抑制作用，以龍井的抑制率最高，當(dāng)濃度達(dá)到4mg·mL-1（以生藥計(jì)）時(shí)，抑制率為30.36%，其IC50值為7.5mg/mL。龍井乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用屬于可逆過(guò)程，其抑制類型為混合型，KI為3.1，KIS為9.3。

酪氨酸酶，龍井乙醇提取物，抑制作用，動(dòng)力學(xué)

酪氨酸酶（tyrosinase，EC1.14.18.1）具有多種特征性催化活性，廣泛存在于人、動(dòng)物、植物和微生物中，是一種以Cu2+為輔助因子的金屬酶［1-3］，兼有加氧酶和氧化酶的雙重功能，它能夠催化單酚羥化成二酚，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促條件下形成反應(yīng)終產(chǎn)物黑色素。這一過(guò)程主要與人體色素沉著性疾病、果蔬褐變及昆蟲的傷口愈合等有密切的關(guān)系。因此，多年來(lái)酪氨酸酶一直受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注，其研究涉及生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)等學(xué)科和領(lǐng)域。酪氨酸酶抑制劑（Tyrosinase Inhibitor，TI）通過(guò)抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素生成，它可以降低產(chǎn)品褐變程度從而可以作為保鮮劑，也可用于色素增加性皮膚?。S褐斑、雀斑等）的臨床治療，還可用于化妝品使膚色增白。此外，還有可能應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上作為一種害蟲調(diào)控劑和食品工業(yè)上作為食品添加劑。由于酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用廣泛，近年來(lái)許多學(xué)者致力于尋找高效的酪氨酸酶抑制劑，并研究其抑制作用機(jī)理、抑制動(dòng)力學(xué)以及應(yīng)用條件等。傳統(tǒng)的酪氨酸酶抑制劑大多是化學(xué)合成的，毒副作用明顯，使其應(yīng)用備受質(zhì)疑。因此，從天然產(chǎn)物中制備酪氨酸酶抑制劑得到人們的普遍關(guān)注，是今后的主要研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-酪氨酸、L-多巴、酪氨酸酶（25KU） sigma公司；龍井 購(gòu)于天津正興德茶莊；柿葉、貢菊、銀杏葉購(gòu)于天津敬一堂藥店。

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；UV-1700紫外可見分光光度計(jì)、AUY120電子分析天平 島津；XH-100A微波催化合成/萃取儀 北京祥鴿科技發(fā)展有限公司；分析數(shù)據(jù)用 Excel統(tǒng)計(jì)軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品液的制備 將龍井、柿葉、貢菊和銀杏葉烘干、粉碎后，分別稱取粉末5g，加體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇150mL，室溫浸泡24h后，置于微波萃取儀中進(jìn)行提取。提取條件為：微波功率 500W，提取30min，提取溫度50℃。冷卻后過(guò)濾，在50℃條件下減壓濃縮，濃縮液定容于50mL容量瓶中。

1.2.2 酪氨酸酶活性抑制率的測(cè)定［4-7］原理：在酪氨酸酶反應(yīng)生成黑色素的過(guò)程中，酪氨酸酶的催化作用主要發(fā)生在酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴以及多巴轉(zhuǎn)化為多巴醌這兩個(gè)反應(yīng)中。多巴醌是一種有色物質(zhì)，在475nm處有特征吸收，故可以用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定［8］。

酪氨酸酶的單酚酶活力測(cè)定是以L-酪氨酸為底物，二酚酶活力測(cè)定是以L-多巴為底物。L-酪氨酸溶液、L-多巴溶液、酪氨酸酶溶液及樣品溶液均以磷酸緩沖液（pH6.8）配制。測(cè)定時(shí)，用吸管按表1所示體積，準(zhǔn)確吸取A，B，C，D四組反應(yīng)液，每組設(shè)3個(gè)平行試管，充分混勻后，在37℃水浴溫育30min迅速轉(zhuǎn)移至比色皿中于475nm處測(cè)吸光值。以下列公式計(jì)算酪氨酸酶的抑制百分率：

式中：A為A組反應(yīng)液在475nm下的吸光度值；B為B組反應(yīng)液在475nm下的吸光度值；C為C組反應(yīng)液在475nm下的吸光度值；D為D組反應(yīng)液在475nm下的吸光度值。

表1 反應(yīng)液的組成

1.2.3 酪氨酸酶活力的測(cè)定［9］酪氨酸酶的單酚酶活力測(cè)定是以L-酪氨酸為底物，二酚酶活力測(cè)定是以L-多巴為底物。在3mL pH6.8磷酸緩沖液的測(cè)活體系中，先加入0.1mL含不同濃度的抑制劑于比色杯中，再加入2.8mL預(yù)先在30℃恒溫水浴中保溫的底物溶液，然后加入酪氨酸酶水溶液，立刻混勻，在30℃恒溫條件下、波長(zhǎng)475nm處測(cè)定光密度值隨時(shí)間的增長(zhǎng)曲線，酪氨酸酶活力單位（U/min）規(guī)定：以每分鐘反應(yīng)液在475nm波長(zhǎng)的光密度值增加0.001為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 四種原料乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響

將四種原料的乙醇提物用pH6.8的磷酸緩沖液分別配制成濃度為4mg·mL-1（以生藥計(jì)）的溶液，按表1反應(yīng)體系測(cè)定其對(duì)酪氨酸酶單酚酶和二酚酶的抑制率，結(jié)果見表2。

表2 4種原料對(duì)酪氨酸酶抑制率

從表2可知，龍井乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶單酚酶的活性有明顯的抑制作用，而對(duì)二酚酶活力的抑制作用不明顯；柿葉、貢菊和銀杏葉對(duì)酪氨酸酶單酚酶的活性抑制作用大致相同，但貢菊對(duì)酪氨酸酶二酚酶則表現(xiàn)出一定的激活作用。

2.2 不同濃度的龍井乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶單酚酶的影響

將抑制率最高的龍井乙醇提取物分別配成濃度為2、4、6、8、10、20mg/mL溶液，按表1反應(yīng)體系測(cè)定其對(duì)酪氨酸酶單酚酶的抑制率，結(jié)果見圖1。

圖1 龍井乙醇提物對(duì)酪氨酸酶活性的影響

由圖1可知，龍井乙醇提取物濃度在低于15mg/mL時(shí)，其對(duì)酪氨酸酶的抑制率隨著濃度增大而增強(qiáng)，濃度在15mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到最大，濃度高于15mg/mL時(shí)抑制率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。用曲線擬合算出龍井乙醇提取物導(dǎo)致酶活力下降一半所需的抑制劑含量（IC50）為7.5mg/mL。

2.3 龍井乙醇提取物抑制酪氨酸酶單酚酶的動(dòng)力學(xué)觀察

2.3.1 龍井乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制效應(yīng) 以濃度不變的酪氨酸為底物，改變酶蛋白加入量，分別測(cè)定不同濃度龍井乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶催化酪氨酸氧化活力的影響。圖2表示酪氨酸酶經(jīng)龍井乙醇提取物作用后的剩余酶活力與加入的酶量間的關(guān)系，得到一組通過(guò)原點(diǎn)的直線，隨著加入的龍井乙醇提取物的增多，直線的斜率逐漸下降，說(shuō)明龍井乙醇提取物對(duì)該酶的抑制作用屬于可逆過(guò)程，增加效應(yīng)物含量導(dǎo)致酶活力的下降，說(shuō)明效應(yīng)物和酶的結(jié)合導(dǎo)致酶活力受抑制，并不導(dǎo)致酶的分子構(gòu)象的永久變化而失活。

圖2 樣品對(duì)酪氨酸酶抑制作用機(jī)理的判斷

2.3.2 龍井乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理及抑制常數(shù)的測(cè)定 在測(cè)活體系中，固定酶液濃度，改變底物酪氨酸濃度，測(cè)定不同濃度龍井乙醇提取物對(duì)酶活力的影響。Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖均為相交于第二象限的一組直線，說(shuō)明龍井乙醇提取物作為酪氨酸酶抑制劑，可以改變酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速度（Vmax）和米氏常數(shù)（Km），其抑制類型為混合型。圖3（a）為龍井乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶抑制作用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，Km值隨著效應(yīng)物含量的增大而增大，Vmax隨著效應(yīng)物含量增大而下降，表明龍井乙醇提取物既影響酶對(duì)底物的親和力也影響酶的催化作用，該提取物既能與游離酶（E）結(jié)合，也能與酶-底物絡(luò)合物（ES）結(jié)合，但抑制作用強(qiáng)度不同。分別以雙倒數(shù)直線的斜率和縱軸截距對(duì)效應(yīng)物含量二次作圖，以斜率圖3（b）和縱軸截距圖3（c）對(duì)提取物含量作圖為直線，分別可以求出效應(yīng)物對(duì)游離酶抑制常數(shù)（KI）為3.1和對(duì)酶-底物絡(luò)合物抑制常數(shù)（KIS）為9.3。

圖3 樣品對(duì)酪氨酸酶抑制類型和抑制常數(shù)的測(cè)定

3 結(jié)論

龍井、柿葉、貢菊和銀杏葉提取物對(duì)酪氨酸酶單酚酶的活性有明顯的抑制作用，其中龍井的抑制率最高達(dá)到了30.36%，而對(duì)二酚酶活力的抑制作用不明顯，貢菊對(duì)酪氨酸酶二酚酶則表現(xiàn)出一定的激活作用，龍井乙醇提取物的IC50值為7.5mg/mL。

龍井乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用屬于可逆過(guò)程，增加效應(yīng)物含量導(dǎo)致酶活力的下降，說(shuō)明效應(yīng)物和酶的結(jié)合導(dǎo)致酶活力受抑制，并不導(dǎo)致酶的分子構(gòu)象的永久變化而失活。龍井乙醇提取物作為酪氨酸酶抑制劑，可以改變酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速度（Vmax）和米氏常數(shù)（Km），其抑制類型為混合型。龍井乙醇提取物既影響酶對(duì)底物的親和力也影響酶的催化作用，該提取物既能與游離酶（E）結(jié)合，也能與酶-底物絡(luò)合物（ES）結(jié)合，但抑制作用強(qiáng)度不同，KI和KIS分別為3.1和9.3。這說(shuō)明龍井乙醇提取物對(duì)酪氨酸游離酶（E）的抑制作用較對(duì)酶-底物絡(luò)合物（ES）的抑制作用強(qiáng)的多。本實(shí)驗(yàn)論證了龍井乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制效果，為綠茶提取物在果蔬保鮮方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，對(duì)酪氨酸酶起抑制作用的龍井乙醇提取物的具體有效成分還有待進(jìn)一步的研究。

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Inhibitory mechanism of ethanol extracts from longjing on tyrosinase activity

MA Yan-yan，LU Xiao-xiang*
（Tianjin Key Laboratory Food of Biotechnology，Biotechnology and Food Science College，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

Longjing，persimmon leaf，florists chrysanthemum and ginkgo biloba were used as experimental materials.The inhibitory of these ethanol extracts on tyrosinase activities were examined with L-Tryosine and LDOPA as substrate.The results showed that the ethanol extracts from 4 drugs all had obvious inhibitory activity on tyrosinase，the strongest effects occurred with longjing ethanol extract，the maximum inhibition rate was 30.36%at concentration of 4mg·mL-1，lC50was 7.5mg/mL.Ethanol extracts from longjing showed reversibly inhibitors to tyrosinase and the type of inhibition belonged to be mixed-type，Klwas 3.1and KlSwas 9.3.

tyrosinase；ethanol extracts from longjing；inhibitory mechanism；kinetics

TS201.2+5

A

1002-0306（2010）11-0141-03

2009-11-25 *通訊聯(lián)系人

馬燕燕（1985-），女，在讀碩士，研究方向：食物資源研究與開發(fā)。