于 洲，徐海濱

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所，北京 100021)

異硫氰酸鹽(isothiocyanates，ITC)是對(duì)一類(lèi)具有N=C=S結(jié)構(gòu)的小分子化合物的總稱(chēng)，其在十字花科包括西蘭花、卷心菜、芥藍(lán)、花莖橄欖和孢子甘藍(lán)等蔬菜中含量豐富，在現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的大約20多種ITC中，通過(guò)飲食常接觸的主要包括:烯丙基異硫氰酸鹽(allyl isothiocyanate)、苯甲基異硫氰酸鹽(benzyl isothiocyanate，BITC)、苯乙基異硫氰酸鹽(phenethyl isothiocyanate，PEITC)和萊菔硫烷(sulforaphane)，它們都具有對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、腫瘤等疾病的保健及治療作用［1］。但目前ITC毒性資料僅局限于其作為風(fēng)味劑等在較低攝入量水平時(shí)的風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)價(jià)，對(duì)作為膳食補(bǔ)充劑或保健食品等攝入ITC可能導(dǎo)致的健康風(fēng)險(xiǎn)，現(xiàn)有的安全性的評(píng)價(jià)資料尚不完備。近年又有報(bào)道已廣泛使用的ITC的某些成分中可能存在對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的母體毒性和胚胎毒性作用［2］，這引起了其在食用安全性方面的關(guān)注。

因此本研究將利用胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESC)體外經(jīng)懸浮、懸滴培養(yǎng)分化為心肌細(xì)胞［3］和經(jīng)視黃酸(retinoic acid)誘導(dǎo)培養(yǎng)分化為神經(jīng)細(xì)胞［4］的方法，以分化獲得的心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞為觀察終點(diǎn)，對(duì)BITC和PEITC可能的發(fā)育毒性作用進(jìn)行篩選和評(píng)價(jià)，為ITC的食用安全性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

129品系小鼠胚胎干細(xì)胞D3細(xì)胞和BALB/c品系小鼠3T3細(xì)胞均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 試劑與儀器

PEITC(純度99%)和 BITC(純度98%)購(gòu)自Sigma公司，敲除DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶/依地酸(trypsin/EDTA)、特級(jí)胎牛血清、谷氨酰胺、β-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)、非必需氨基酸、磷酸鹽0.1 mol·L－1緩沖液、羥乙基哌嗪乙磺酸〔4-(2-hydroxyerthyl)piperazine-1-erthanesulfonic acid〕、軟瓊脂、白血病抑制因子和視黃酸購(gòu)自Sigma公司;二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒、Trizol細(xì)胞裂解液購(gòu)自Invitrogen公司;Taq DNA聚合酶購(gòu)自上海生物工程公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。IX71倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、TOMY LC-120低速離心機(jī)(日本Tomy公司)、低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)、TGL-16B臺(tái)式高速離心機(jī)(重慶安科醫(yī)療器械公司)、PCR儀(德國(guó)Biometra公司)和凝膠成像儀(上海天能科技有限公司)。

1.3 胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)［3］

取出－180℃液氮冷凍條件下保存的ESC D3細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，接種于備用的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast)飼養(yǎng)層上，加入含15%特級(jí)胎牛血清、β-巰基乙醇 0.1 mmol·L－1、羥乙基哌嗪乙磺酸 1 mmol·L－1、谷氨酰胺 2 mmol·L－1、1%非必需氨基酸及1×106U·L－1白血病抑制因子的敲除DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行維持培養(yǎng)。為保持其理想的未分化狀態(tài)，當(dāng)胚胎干細(xì)胞團(tuán)集落達(dá)到60% ～70%融合時(shí)，即需傳代。

1.4 苯甲基異硫氰酸鹽和苯乙基異硫氰酸鹽對(duì)胚胎干細(xì)胞D3和3T3細(xì)胞毒性的檢測(cè)［5］

分別將200μl 500個(gè)BALB/c 3T3細(xì)胞和129小鼠D3細(xì)胞分別接種在96孔培養(yǎng)板上，每孔中加入BITC 和 PEITC 0.5，1，2，4，6，8，10，12 和 14 μmol·L－1，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組。第3和第5天更換培養(yǎng)基，第10天用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，于波長(zhǎng)570和630 nm處檢測(cè)量其吸光度值(A)，制成濃度-反應(yīng)曲線，求出BITC和PEITC對(duì)細(xì)胞活性的半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration，IC50)，其中對(duì)ESCD3細(xì)胞活性半數(shù)抑制濃度以IC50(D3)表示，對(duì)3T3細(xì)胞活性的半數(shù)抑制濃度以IC50(3T3)表示。

1.5 苯甲基異硫氰酸鹽和苯乙基異硫氰酸鹽抑制胚胎干細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞能力的檢測(cè)［7］

根據(jù)文獻(xiàn)［6］及ESC活性抑制的檢測(cè)結(jié)果，取DMSO溶解的BITC和PEITC用上述ESC培養(yǎng)液(無(wú)白血病抑制因子)溶解至濃度為0，1，2，4和8 μmol·L－1。BITC和PEITC抑制 ESC體外分化為心肌細(xì)胞能力檢測(cè)方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［7］。

1.6 苯甲基異硫氰酸鹽和苯乙基異硫氰酸鹽抑制胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)細(xì)胞能力檢測(cè)［8］

1.6.1 懸滴、懸浮培養(yǎng)

取生長(zhǎng)旺盛的ESC，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化成單細(xì)胞懸液，加入ESC培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至1×105L－1后滴于直徑10 cm的細(xì)菌培養(yǎng)皿蓋板上，每滴30μl，隨即將培養(yǎng)皿蓋倒扣于培養(yǎng)皿上，形成細(xì)胞懸滴。將此培養(yǎng)皿放入37℃，50%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。以1%軟瓊脂鋪底于6 cm細(xì)菌培養(yǎng)皿中，將懸滴培養(yǎng)3 d由ESC形成的胚體(embryonic bodies)轉(zhuǎn)入其中繼續(xù)懸浮培養(yǎng)1 d。懸滴、懸浮培養(yǎng)階段所用培養(yǎng)基不含白血病抑制因子和β-巰基乙醇，胎牛血清也由常規(guī)培養(yǎng)時(shí)的15%增加到胚體培養(yǎng)階段的20%。

1.6.2 視黃酸誘導(dǎo)的ESC神經(jīng)定向分化

將上述懸浮培養(yǎng)的胚體轉(zhuǎn)移至黏附性組織培養(yǎng)瓶中，加入含上述BITC和PEITC的ESC培養(yǎng)基(無(wú)白血病抑制因子)，同時(shí)加入視黃酸(終濃度為0.5 μmol·L－1)進(jìn)行神經(jīng)分化誘導(dǎo)。上述含 BITC和PEITC和視黃酸的培養(yǎng)基，每2 d換液1次，于誘導(dǎo)后第4天停用。

1.7 RT-PCR法檢測(cè)分化特異基因表達(dá)

不同濃度BITC和PEITC分化培養(yǎng)的ESC，用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化成單細(xì)胞懸液，磷酸鹽緩沖液 0.1 mol·L－1清洗 2 遍后，采用 Trizol試劑盒提取 ESC總 RNA，并用紫外分光光度計(jì)，選擇A260/280檢測(cè)以確定RNA濃度與質(zhì)量。取1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，以DL1500作為核酸相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)志，紫外燈下觀察結(jié)果并照像。心肌分化特異基因肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)引物為 反向:5'-ACCTGTCCAAGTTCCGCAAG-3'，正向:5'-CTTGTTGACCTGGGACTCGG-3';心肌分化特異巢蛋白基因引物為反向:5'-CTCGAGCAGGAAGTGGTAGG-3'，正向:5'-TTGGGACCAGGGACTGTTAG-3';內(nèi)對(duì)照基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因引物為反向:5'-GCACAGTCAAGGCCGAGAAT-3'， 正 向:5'-ACGTCAGATCCACGACGGAC-3'。ɑ/β-MHC、巢蛋白和GAPDH基因擴(kuò)增退火溫度分別為60℃、55℃和62℃，循環(huán)次數(shù)均為 34 次［7－8］。

1.8 苯甲基異硫氰酸鹽和苯乙基異硫氰酸鹽的發(fā)育毒性分析［5］

采用UVISoft UVIBand Application V97.04分析軟件對(duì)上述分化獲得的心肌細(xì)胞內(nèi)MHC基因、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)巢蛋白基因擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖像進(jìn)行灰度分析，且以GAPDH為內(nèi)對(duì)照基因，繪成濃度-反應(yīng)曲線，計(jì)算BITC、PEITC對(duì)ESC體外定向分化抑制率為50%時(shí)的作用濃度，即半數(shù)抑制濃度ID50，其中對(duì)ESC體外心肌細(xì)胞定向分化半數(shù)抑制濃度以ID50(D3，MHC)表示，神經(jīng)細(xì)胞定向分化半數(shù)抑制濃度以ID50(D3，巢蛋白)表示。

評(píng)價(jià)發(fā)育毒性計(jì)算公式為:公式Ⅰ=5.9157×lg〔IC50(3T3)〕+3.500 lg〔IC50(D3)〕－ 5.307 ×〔IC50(3T3)－ ID50(D3)〕/IC50(3T3)－15.72;公式Ⅱ =3.651×lg〔IC50(3T3)〕+2.394×lg〔IC50(D3)〕－2.033〔IC50(3T3)－ ID50(D3)〕/IC50(3T3)－6.85;公 式 Ⅲ = －0.125×lg〔IC50(3T3)〕+1.917 × lg〔IC50(D3)〕+1.500〔IC50(3T3)－ID50(D3)〕/IC50(3T3)－2.67;且公式中均以mg·L－1為單位。IC50(D3)和 IC50(3T3)分別為D3和3T3細(xì)胞活性的半數(shù)抑制濃度;ID50(D3)為D3細(xì)胞體外定向分化為心肌細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞的定向分化半數(shù)抑制濃度。

評(píng)價(jià)發(fā)育毒性的判定標(biāo)準(zhǔn)為:上述結(jié)果中，Ⅰ＞Ⅱ且Ⅰ＞Ⅲ，則判定BITC和PEITC發(fā)育毒性為無(wú)發(fā)育毒性;如Ⅱ ＞Ⅰ且Ⅱ ＞Ⅲ，則判定 BITC和PEITC發(fā)育毒性為弱發(fā)育毒性;如Ⅲ＞Ⅰ且Ⅲ＞Ⅱ，則判定BITC和PEITC發(fā)育毒性為強(qiáng)發(fā)育毒性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 苯甲基異硫氰酸鹽和苯乙基異硫氰酸鹽對(duì)細(xì)胞存活率的影響

由表1結(jié)果顯示，BITC和PEITC作用1 0 d后，ESC D3和3T3細(xì)胞的存活率隨著 BITC和PEITC濃度的增加而明顯降低，并呈一定的濃度依賴性;當(dāng)達(dá)到BITC和PEITC設(shè)計(jì)的最大毒性作用濃度14 μmol·L－1時(shí)，BITC 作用條件下 ESC D3和3T3細(xì)胞存活率分別僅為無(wú)BITC和PEITC作用條件下細(xì)胞活性的28%和12%，PEITC作用條件下為28%和15%，可見(jiàn)BITC和PEITC均具有一定的抑制細(xì)胞存活率作用，且上述兩種細(xì)胞對(duì)BITC和PEITC細(xì)胞活性抑制作用的敏感性差別不大。依據(jù)濃度-反應(yīng)曲線計(jì)算，BITC對(duì)ESC D3和3T3細(xì)胞存活率的IC50(D3)和 IC50(3T3)分別為1.23和0.95 mg·L－1，PEITC 相應(yīng)的 IC50(D3)和 IC50(3T3)分別為 1.26 和 0.98 mg·L－1。

2.2 苯甲基異硫氰酸鹽和苯乙基異硫氰酸鹽抑制胚胎干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的作用

由圖1和表2可見(jiàn)，體外ESC經(jīng)懸滴、懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后可獲得能夠表達(dá)MHC基因的心肌樣細(xì)胞，但隨著B(niǎo)ITC和PEITC作用濃度的增加，ESC定向分化為心肌細(xì)胞的能力逐漸降低。BITC和PEITC 2 μmol·L－1時(shí)，與 BITC 和 PEITC 0 μmol·L－1相比較，ESC定向分化為心肌細(xì)胞的分化率分別為89%和92%;當(dāng) BITC 和 PEITC 8 μmol·L－1，ESC 分化為心肌細(xì)胞的分化率降至83%和84%。依據(jù)濃度-反應(yīng)曲線計(jì)算，BITC和PEITC抑制50%ESC定向分化為心肌細(xì)胞的 ID50(D3，MHC)分別為3.56和 3.48 mg·L－1。

2.3 苯甲基異硫氰酸鹽和苯乙基異硫氰酸鹽抑制胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的作用

圖2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，ESC體外懸滴、懸浮培養(yǎng)后，經(jīng)視黃酸0.5 μmol·L－1誘導(dǎo)分化獲得一定數(shù)目可表達(dá)特異性巢蛋白基因的神經(jīng)樣細(xì)胞。由表3可見(jiàn)，隨著B(niǎo)ITC和PEITC作用濃度的增加，ESC神經(jīng)定向分化獲得具有表達(dá)巢蛋白基因的神經(jīng)樣細(xì)胞的能力均受到抑制，且抑制作用隨BITC和PEITC作用濃度的增加而增強(qiáng);BITC和PEITC 2 μmol·L－1與 BITC 和 PEITC 0 μmol·L－1相比較，ESC定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的分化率為92%和87%;BITC和PEITC為8 μmol·L－1時(shí)，ESC定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的分化效率僅為81%和74%。依據(jù)濃度-反應(yīng)曲線計(jì)算，BITC和PEITC抑制50%ESC定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的ID50(D3，巢蛋白)分別為3.87和2.43 mg·L－1。

表1 苯甲基異硫氰酸鹽(BITC)和苯乙基異硫氰酸鹽(PEITC)對(duì)胚胎干細(xì)胞和BALB/C(3T3)細(xì)胞存活率的影響Tab.1 Effect of benzyl isothiocyanate(BITC)and phenethyl isothiocyanate(PEITC)on embryonic stem cells and BALB/C(3T3)cells survival

圖1 BITC(A)和PEITC(B)對(duì)胚胎干細(xì)胞體外定向分化獲得表達(dá)肌球蛋白重鏈(MHC)基因的心肌細(xì)胞能力的影響.將BITC和PEITC加入胚胎干細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，經(jīng)懸滴、懸浮誘導(dǎo)培養(yǎng)10 d后，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法法檢測(cè)分化獲得的細(xì)胞內(nèi)心肌細(xì)胞特異肌球蛋白重鏈(MHC)基因和管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá)，圖中M:DNA標(biāo)志，條帶1～5:分別為BITC和PEITC 0，1，2，4 和8 μmol·L－1.Fig.1 Effect of BITC and PEITC on the embryonic stem cells differentation into cardiomyocyte cells with myosin heavy chain expression.

表2 BITC和PEITC對(duì)胚胎干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞能力的影響Tab.2 Effect of BITC and PEITC on the embryonic stem cells differentation into cardiomyocyte cells

圖2 BITC(A)和PEITC(B)對(duì)胚胎干細(xì)胞體外定向分化獲得特異表達(dá)巢蛋白基因的神經(jīng)細(xì)胞能力的影響.懸滴、懸浮培養(yǎng)4 d后，將BITC和PEITC加入胚胎干細(xì)胞分化培養(yǎng)基中，同時(shí)加入視黃酸再神經(jīng)定向分化誘導(dǎo)培養(yǎng)4 d，收集細(xì)胞后采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)分化獲得的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞特異巢蛋白基因和管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的表達(dá).M:DNA標(biāo)志，條帶1～5:BITC和PEITC 0，1，2，4 和8 μmol·L－1.Fig.2 Effect of BITC and PEITC on the embryonic stem cells differentation into neuron cells with nestin expression.

2.4 苯甲基異硫氰酸鹽和苯乙基異硫氰酸鹽的發(fā)育毒性

由表4可見(jiàn)，分別將BITC和PEITC相對(duì)應(yīng)的ID50(D3，MHC)、ID50(D3，巢蛋白)和 IC50(D3)、IC50(3T3)值，按照材料和方法1.8項(xiàng)下發(fā)育毒性公式計(jì)算，BITC和PEITC心肌發(fā)育毒性公式Ⅰ＞Ⅱ，同時(shí)Ⅰ＞Ⅲ，判定BITC和PEITC均無(wú)心肌發(fā)育毒性，BITC的神經(jīng)發(fā)育毒性公式Ⅰ＞Ⅱ，同時(shí)Ⅰ＞Ⅲ，所以判定BITC無(wú)神經(jīng)發(fā)育毒性。PEITC的神經(jīng)發(fā)育毒性公式Ⅱ＞Ⅰ，同時(shí)Ⅱ＞Ⅲ，依據(jù)發(fā)育毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，判定BITC神經(jīng)發(fā)育弱毒性。

3 討論

ESC是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass)中分離出來(lái)的具有多向分化潛能的細(xì)胞系，它在體外既可維持不分化而無(wú)限增殖，又能參與胚胎發(fā)育分化為各種類(lèi)型細(xì)胞和組織而形成器官，因此被稱(chēng)為多(潛)能性細(xì)胞［9］。ESC在適當(dāng)?shù)捏w外培養(yǎng)條件下能形成一種稱(chēng)為胚體的結(jié)構(gòu)，分化出多種細(xì)胞譜系，包括原始外胚層、臟層和壁層內(nèi)胚層以及早期中胚層，并產(chǎn)生各種細(xì)胞類(lèi)型如心肌細(xì)胞、肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及血管平滑肌細(xì)胞。由于缺乏空間調(diào)控信號(hào)，胚胎干細(xì)胞不能完成各組織的形態(tài)發(fā)育，但能在細(xì)胞核分子水平重演胚胎發(fā)育過(guò)程，并且在胚體分化過(guò)程中，早期胚胎發(fā)育的標(biāo)志基因按一定的順序先后表達(dá)，同時(shí)各組織的特異性基因的表達(dá)的順序也很好地重演了體內(nèi)胚胎發(fā)育的基因表達(dá)模式［3］。因此，胚胎干細(xì)胞時(shí)間依賴的分化過(guò)程為哺乳動(dòng)物的發(fā)育生物學(xué)和發(fā)育毒理學(xué)等方面的研究提供一個(gè)非常有價(jià)值的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ突A(chǔ)，通過(guò)BITC和PEITC對(duì)ESC發(fā)育過(guò)程影響的檢測(cè)，可以對(duì)BITC和PEITC是否具有發(fā)育毒性做出比較正確的判斷，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度［10］。

在無(wú)誘導(dǎo)劑的作用條件下，胚胎干細(xì)胞通過(guò)體外懸浮、懸滴培養(yǎng)后具有一定的分化為心肌細(xì)胞的能力，而具有發(fā)育毒性的BITC和PEITC可抑制其這種分化能力［9］。因此將BITC和PEITC分別以不同的濃度作用于胚胎干細(xì)胞的心肌分化過(guò)程，采用RT-PCR和半定量灰度檢測(cè)方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果可見(jiàn)，隨著B(niǎo)ITC和PEITC作用濃度的增加，胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的能力降低，呈一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系，ID50(D3，MHC)依次為 3.56 和 3.87 mg·L－1;同時(shí)結(jié)合BITC和PEITC相應(yīng)的抑制細(xì)胞活性的分析結(jié)果 IC50(3T3)和IC50(D3)，根據(jù)歐洲替代方法驗(yàn)證中心(theEuropeanCenterfortheValidationof Alternative Methods，ECVAM)提供的判定方法和標(biāo)準(zhǔn)，BITC和PEITC的心肌發(fā)育毒性評(píng)價(jià)結(jié)論均為無(wú)心肌發(fā)育毒性。

表3 BITC和PEITC對(duì)胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞能力的影響Tab.3 Effect of BITC and PEITC on the embryonic stem cells differentation into neuron cells

表4 BITC和PEITC發(fā)育毒性評(píng)價(jià)Tab.4 The developmental toxicity evaluation of BITC and PEITC

選擇ESC向心肌細(xì)胞分化作為判斷發(fā)育毒性的終點(diǎn)之一，可以建立和評(píng)價(jià)ITC基于心肌分化模型的發(fā)育毒性，這一點(diǎn)對(duì)于評(píng)價(jià)多數(shù)化合物發(fā)育毒性，尤其是心臟發(fā)育毒性/畸形是有效的。但是對(duì)于那些不能作用于早期心臟發(fā)育而特異性地抑制其他組織，如神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的致畸物，這一模型檢測(cè)靈敏度低且不能涵蓋所有發(fā)育毒性的作用特點(diǎn)，同時(shí)對(duì)于BITC和PEITC抑制神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的的機(jī)制及分化后可能的神經(jīng)細(xì)胞特性的改變也未給予評(píng)價(jià)，需要通過(guò)建立和完善新的發(fā)育模型給予重視和研究［11］。因此，本研究中利用經(jīng)視黃酸誘導(dǎo)法建立的胚胎干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)育毒性評(píng)價(jià)模型，有助于進(jìn)一步評(píng)價(jià)ITC可能的神經(jīng)發(fā)育毒性作用。

在胚胎干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)育毒性評(píng)價(jià)模型中，同樣采用RT-PCR和半定量灰度檢測(cè)方法對(duì)神經(jīng)細(xì)胞特異性巢蛋白基因表達(dá)的結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，隨著上述BITC和PEITC作用濃度的增加，胚胎干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)細(xì)胞的能力降低，并呈一定的劑量-反應(yīng)關(guān)系，ID50(D3)巢蛋白分別為 3.48 mg·L－1和2.43 mg·L－1，結(jié)合上述的3T3、D3 細(xì)胞抑制分析的結(jié)果，同樣依據(jù)ECVAM的公式計(jì)算分析，判定BITC為無(wú)神經(jīng)發(fā)育毒性物，PEITC為弱神經(jīng)發(fā)育毒性物。上述模型評(píng)價(jià)結(jié)果的差異提示，在胚胎干細(xì)胞不同的定向分化過(guò)程中，其所涉及相關(guān)的分化控制基因和信號(hào)通路不盡相同，即胚胎干細(xì)胞必需接受不同的信號(hào)從而向不同方向分化［12］。因此，BITC和PEITC對(duì)ESC定向分化過(guò)程中的影響，局限于相應(yīng)特定的基因表達(dá)調(diào)控和信號(hào)通路，這一研究結(jié)果有利于發(fā)現(xiàn)和解釋BITC和PEITC特異的發(fā)育毒性靶器官及其毒性作用特點(diǎn)。

目前，BITC和PEITC的一般毒性、遺傳毒性和致癌性的作用已有報(bào)道［13－14］，但對(duì)于其發(fā)育毒性，尤其是神經(jīng)發(fā)育毒性仍未見(jiàn)相關(guān)的研究。本研究結(jié)果提示，PEITC具有弱神經(jīng)發(fā)育毒性，需要在ITC的利用過(guò)程中對(duì)其特殊發(fā)育毒性作用給予關(guān)注，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)一步研究。

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