梁曉雯，周 靜，黃 艷，于民權，程 旸，方泰惠，金 路，許 立

(南京中醫(yī)藥大學1.藥學院江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，2.基礎醫(yī)學院組織胚胎學教研室，江蘇南京 210029)

環(huán)維黃楊星D(cyclovirobuxine D，CVB-D)系從黃楊科植物小葉黃楊(Buxus microphylla Sieb.et Zucc.var.sinica Rehd.et Wils.)及其同屬植物中提取的一種生物堿，為我國研制成功的治療心腦血管疾病的新藥，具有行氣活血和通絡止痛功能，主要用于治療氣滯血瘀所致的胸痹心痛、冠心病和心律失常。它對心血管系統(tǒng)具有強心，抗心絞痛和抗心律失常等作用［1－2］。對CVB-D的藥理及藥效報道較多，而對于其毒理學研究報道較少。

CVB-D較大劑量長期應用，無論是口服或靜脈注射給藥，均可對肝臟、心臟、腎臟等器官產(chǎn)生毒性作用，嚴重的可引起死亡［1，3］。近來研究發(fā)現(xiàn)，大鼠ip給予CVB-D 8 mg·kg－13個月，有3只動物給藥期間出現(xiàn)精神萎靡、反應遲鈍等毒性反應，且BUN明顯升高;CVB-D 4和8 mg·kg－1組部分動物出現(xiàn)腎臟的遠曲小管上皮細胞變性、壞死及蛋白管型等病理改變［4］。

本實驗在前期研究的基礎上，大鼠連續(xù)ip給予CVB-D 2個月，觀察CVB-D致大鼠腎臟毒性的劑量和時間依賴性關系，并探討其腎臟毒性的可逆性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品、試劑與儀器

SD大鼠，清潔級，80～100 g，120只，雌雄各半;浙江省實驗動物中心，許可證號:SCXK(浙)2003-001。實驗前，大鼠給予適應性喂養(yǎng)1周。CVB-D:為白色粉末狀結(jié)晶，南京小營藥廠提供，純度≥96%，批號:20050802。由于CVB-D難溶于PBS，故臨用前用PBS配成所需濃度，加入微量冰乙酸(終濃度不超過0.1%)，將CVB-D全部溶解，pH在6.5左右。尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)測試盒、肌酐(creatinine，SCr)測試盒、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG)酶測試盒:南京建成生物工程研究所;大鼠尿液β2微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)，免疫球蛋白 G(immunoglobulin G，IgG)，視黃醇結(jié)合蛋白(retinol binding protein，RBP)，微量白蛋白(microalbumin，mAlb)和轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin，TRF)測試盒:美國ADL羊抗鼠β2-microglobulin ELISA測定試劑盒，Lot No.RT110371;大鼠血清Tamm Horsfall蛋白(Tamm Horsfall protein，THP)和 β2-MG測試盒:美國 ADL羊抗鼠β2-microglobulin ELISA測定試劑盒，Lot No.RT110371。AY120型電子天平:日本 Shimadzu公司;Vital-200全自動生化分析儀:荷蘭威圖科學儀器公司;全自動尿液分析儀:日本Sysmex公司;80-2型臺式離心機:上海醫(yī)療器械有限公司手術器械廠。

1.2 動物分組和給藥

大鼠雌雄分籠飼養(yǎng)，自由飲水，室溫20～25℃，每天人工光照12 h，室內(nèi)通風良好，實驗室相對濕度為65%～70%。

SD大鼠120只，雌雄各半，隨機分為4組，每組30只大鼠。正常對照組:PBS溶液(含0.1%的冰乙酸);CVB-D 2.5，5 和10 mg·kg－1，相當于人用量的25，50 和100 倍;給藥體積為5 ml·kg－1。大鼠ip給予CVB-D，連續(xù)給藥2個月，分別在首次給藥后第1個月末和第2個月末每組取10只大鼠，雌雄各半，觀察并檢測各項指標。2個月后各組留10只大鼠，停藥觀察4周，做同樣檢查。

1.3 一般檢查及血液、尿液生化指標測定

每天觀察并記錄動物的一般活動及精神狀態(tài);每隔2 d稱量1次體重以及攝食量，觀察體重與攝食量的動態(tài)變化。分別在第1個月末、第2個月末以及恢復期末，各組取10只大鼠，通過眼眶取血3 ml于促凝管中，分離血清，檢測 BUN，SCr，THP，β2-MG;并且收集24 h尿液，測定NAG，IgG，RBP，mAlb，TRF和 THP。

1.4 組織病理學檢查

第1個月和第2個月末以及恢復期分3批處死大鼠，對腎臟進行肉眼檢查，稱重，用4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚4μm，HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 動物一般體征

大鼠ip給予CVB-D 2周后，體重出現(xiàn)增長緩慢現(xiàn)象。CVB-D 10 mg·kg－1組大鼠在給藥4周后出現(xiàn)反應遲鈍、精神不振、呼吸急促、體重增長緩慢的現(xiàn)象，其中有2只大鼠在給藥6周后出現(xiàn)大便稀溏的現(xiàn)象，并有1只大鼠在給藥5周后死亡。各組攝食量均在正常范圍內(nèi)。上述現(xiàn)象在恢復期得到改善，體重也出現(xiàn)明顯增長的現(xiàn)象，精神狀態(tài)也逐漸好轉(zhuǎn)。

2.2 環(huán)維黃楊星D對大鼠血清中尿素氮、肌酐、β2微球蛋白和Tamm Horsfall蛋白的影響

如表1所示，CVB-D ip給予大鼠1個月后，CVB-D 10 mg·kg－1組大鼠血清中的BUN含量與正常對照組相比明顯升高(P ＜0.01)。CVB-D 2.5，5和 10 mg·kg－1組的β2-MG含量均比正常對照組明顯升高(P ＜0.01)，CVB-D 5 和10 mg·kg－1組的 THP 含量比正常對照組明顯降低(P＜0.01)。給藥2個月后，CVB-D 5和10 mg·kg－1組大鼠血清中β2-MG含量比正常對照組顯著升高(P ＜0.05)，CVB-D 5 mg·kg－1組大鼠血清中的BUN含量比正常對照組顯著升高(P ＜0.05)，CVB-D 10 mg·kg－1組大鼠血清中的 THP含量比正常對照組顯著降低(P＜0.05)。在恢復期內(nèi)，CVB-D 5 mg·kg－1組大鼠血清中的 SCr含量比正常對照組明顯升高(P＜0.05)。

2.3 環(huán)維黃楊星D對大鼠尿酶及尿液中微量蛋白的影響

CVB-D ip給予大鼠1個月后，與正常對照組相比，CVB-D 10 mg·L－1組大鼠尿液中 NAG，TRF，β2-MG和IgG 含量顯著升高(P ＜0.05)，CVB-D 5和10 mg·kg－1組的尿液mAlb含量及RBP含量顯著升高(P＜0.05，P ＜0.01)。給藥 2 個月后，CVB-D 10 mg·kg－1組大鼠尿液中NAG和IgG含量比正常對照組顯著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，CVB-D 5和 10 mg·kg－1組大鼠尿液中的β2-MG和TRF含量比正常對照組明顯升高(P＜0.01)。在恢復期內(nèi)，CVB-D 10 mg·kg－1組大鼠尿液中mAlb和TRF含量比正常對照組顯著升高(P ＜0.05)，CVB-D 2.5 mg·kg－1組 mAlb含量比正常對照組顯著升高(P＜0.05)(表2)。

表1 環(huán)維黃楊星D(CVB-D)對大鼠血清中尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、β2微球蛋白(β2-MG)、Tamm Horsfall蛋白(THP)的影響Tab.1 Effect of cyclovirobuxine D(CVB-D)on blood urea nitrogen(BUN)，creatinine(SCr)，β2-microglobulin(β2-MG)and Tamm Horsfall protein(THP)in rats

表2 CVB-D對大鼠尿酶及尿液中微量蛋白的影響Tab.2 Effect of CVB-D on concent of urease and protein in urine of rats

2.4 環(huán)維黃楊星D對大鼠腎臟組織病理的影響

肉眼觀察可見給藥1個月的大鼠腎臟組織未見異常，給藥2個月及恢復期CVB-D 10 mg·kg－1組部分大鼠腎臟顏色由暗紅變?yōu)榘迭S色，質(zhì)地變硬，其余未見異常。由圖1組織學檢查可見，正常對照組中腎臟組織學改變大致正常，未見明顯病理改變。CVB-D 2.5 mg·kg－1組給藥 1 個月有 2 例動物見腎間質(zhì)內(nèi)數(shù)量不等炎細胞浸潤。CVB-D 2.5 mg·kg－1組給藥2個月有2例動物見腎臟化膿性炎癥，部分腎小球和腎小管壞死，1例動物見腎間質(zhì)內(nèi)少量炎細胞浸潤;CVB-D 5和10 mg·kg－1組分別有1例和2例動物見腎臟包膜增厚，包膜下少量炎細胞浸潤，并且有部分動物出現(xiàn)腎臟組織自溶現(xiàn)象;恢復期中各劑量組均有部分動物見腎間質(zhì)內(nèi)少量炎細胞浸潤，少數(shù)動物腎間質(zhì)內(nèi)淤血明顯。

圖1 CVB-D對大鼠腎臟組織病理變化的影響 (HE×200).A:給藥1個月正常對照組，腎組織結(jié)構正常;B:給藥1個月CVB-D 2.5 mg·kg－1組，腎間質(zhì)炎癥，細胞浸潤;C:給藥2 個月CVB-D 2.5 mg·kg－1組，腎化膿性炎癥 ;D:給藥2 個月CVB-D 10 mg·kg－1組腎包膜炎;E:恢復期 CVB-D 2.5 mg·kg－1組腎間質(zhì)炎癥.Fig 1. Effect of CVB-D on pathology of kidney in rats(HE×200).

3 討論

藥代動力學研究和早期的毒性實驗均顯示CVB-D在體內(nèi)有蓄積作用，且腎臟為分布濃度較高的臟器之一，也是CVB-D的主要排泄器官。其次，已有的犬長期毒性實驗中，有動物在觀察期內(nèi)的BUN升高，死亡的犬尿中出現(xiàn)蛋白、紅細胞、白細胞及貧血的現(xiàn)象。家兔的長期毒性實驗中，大劑量組部分動物遠曲小管及享勒袢起始部位黃色素沉著，遠曲小管上皮細胞核固縮，胞漿有嗜酸性變。均提示CVB-D對腎有影響的可能［1］。前期的研究顯示，在SPF級大鼠和比格犬上，連續(xù)注射給藥后，較大劑量組部分動物有明顯腎臟毒性反應，尿中見有蛋白、上皮細胞及少量管型;血液生化中BUN明顯高于正常對照組;腎臟見有遠曲小管上皮細胞變性、壞死及蛋白管型等病理損傷改變［4］。

尿TRF的升高是腎小球電荷屏障受損的標志［5］。血清β2-MG的升高一般認為是腎小球濾過功能受損或濾過負荷是否增加的情況;而尿液中排出β2-MG增高，則提示腎小管損害或濾過負荷增加。尿液中mAlb和IgG的含量增加均可作為腎小球損傷的敏感指標，其中mAlb測定對早期腎損害的監(jiān)測價值已被公認，現(xiàn)常把它作為糖尿病、高血壓早期腎損害的一個敏感指標。本實驗結(jié)果表明，大鼠ip給予CVB-D后尿液中的 TRF［5］，mAlb和 IgG的含量以及血清中β2-MG的含量比正常對照組均明顯增加，具有顯著性差異，且呈量效關系。同時，通過腎組織病理切片發(fā)現(xiàn)，應用CVB-D給藥2個月后，CVB-D 2.5 mg·kg－1組部分大鼠出現(xiàn)腎小球壞死的現(xiàn)象。可見，CVB-D 長期 CVB-D 2.5 mg·kg－1應用可能導致腎小球濾膜屏障的損傷。

尿液中NAG酶，RBP和β2-MG含量的增加以及THP含量的減少均可作為近端腎小管受損的敏感指標［6－7］。在本實驗中以上指標的含量均隨著劑量的增加及時間的延長而明顯升高，與正常對照組相比具有顯著性差異。這些指標均與血清中BUN和SCr呈相關性。同時在給藥1和2個月后動物出現(xiàn)了腎間質(zhì)炎細胞浸潤，給藥2個月后部分動物出現(xiàn)了腎小管壞死的現(xiàn)象。CVB-D大劑量及長期給藥可能損傷近段腎小管以及導致急性間質(zhì)性腎炎的現(xiàn)象。

在恢復期，血清及尿液中仍有部分指標顯著高于正常對照組，病理組織切片顯示 CVB-D 2.5 mg·kg－1組仍有部分單位出現(xiàn)腎間質(zhì)內(nèi)少量炎細胞浸潤或不同程度淤血的現(xiàn)象?？梢奀VB-D致腎毒性病變在停藥后無法徹底恢復。

［1］梁秉文，張朝位.黃楊寧與心腦血管疾?。跰］.北京:藍天出版社，2000:67-82.

［2］梁 濤，方泰惠，姚秀娟等.環(huán)維黃楊星D藥理研究進展［J］.解放軍藥學學報，2001，17(1):35-37.

［3］劉錫明，姚明輝，方泰惠.環(huán)維黃楊星D的一些心血管作用［J］.中國藥理學報，1982，3(2):101-104.

［4］許 立，梁 濤，徐 立，袁冬平，周玲玲，方泰惠.環(huán)維黃楊星D對大鼠腎臟毒性的初步觀察［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18(2):91-93.

［5］徐一甄，史虹莉，沈稚舟，葉山東，朱禧星，張桂生，等.NIDDM患者轉(zhuǎn)鐵蛋白尿和慢性并發(fā)癥的關系［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，1997，13(2):101-103.

［6］吳偉嵐，衛(wèi)敏江，陳敏怡，陳 難，蘇宛華，陳 妍.尿α1-MG和尿NAG與腎小管間質(zhì)病理變化的關系［J］.上海第二醫(yī)科大學學報，2004，24(5):357-358，392.

［7］Mao JH， HuangYK， Cheng SJ.Urinary microalbumin and retinal-binding protein assay for verifying children's nephron development and maturation［J］.Clin Chim Acta，1997，264(1):127-132.