黃金玲，劉紀(jì)霜，劉志明，，陸秀紅，潘萍紅，陸光藝，秦碧霞，李國(guó)棟，

(1 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣西南寧 530007;2 南寧市試驗(yàn)中心，廣西南寧 530001;3 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530005）

近年來(lái)根結(jié)線蟲Meloidogyne spp.在蔬菜上發(fā)生日趨嚴(yán)重，給蔬菜生產(chǎn)造成巨大損失.生產(chǎn)中主要以化學(xué)殺線劑來(lái)防治，但目前殺線劑品種少，且多為高毒、高殘留農(nóng)藥，不適合在蔬菜上使用.因此生物防治受到廣泛重視，根結(jié)線蟲生物防治天敵資源也在世界不同國(guó)家和地區(qū)被廣泛調(diào)查和篩選［1-6］.細(xì)菌由于易于培養(yǎng)、定殖，與植物根際具有較強(qiáng)的親和力，應(yīng)用前景廣闊.本試驗(yàn)在廣西開展了蔬菜根結(jié)線蟲生防細(xì)菌的篩選，以提供適合當(dāng)?shù)氐纳谰?，為開展無(wú)公害防治蔬菜根結(jié)線蟲奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 根際細(xì)菌的采集與分離

在廣西蔬菜產(chǎn)地采集番茄Solanum lycopersicum、白菜 Brassica pekinensis、芹菜 Apium graveolens、豆角Vigna unguiculata spp.、紅薯 Ipomoea batatas、黃瓜Cucumis sativus、絲瓜 Luffa cylindrica、南瓜 Cucurbita moschata等作物的根際土壤樣品(包括無(wú)根結(jié)線蟲土、根結(jié)線蟲土及根結(jié)線蟲衰退土).采用稀釋分離法，于NA培養(yǎng)基平板上進(jìn)行根際細(xì)菌的分離，所得分離物純化后保存、備用.

1.2 供試根結(jié)線蟲的繁殖與準(zhǔn)備

供試根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita(Kofoid and White，1919)Chitwood，1949.采用活體繁殖方法，將番茄苗種到南方根結(jié)線蟲病圃中繁殖.從感病的番茄根部挑取南方根結(jié)線蟲新鮮卵塊，用φ為1%NaClO溶液表面消毒后，用滅菌水沖洗3次，置25℃恒溫箱中孵化.待孵化后收集幼蟲，并配制成約100條/mL的線蟲液，備用.

1.3 生防菌室內(nèi)篩選

細(xì)菌菌懸液對(duì)線蟲的作用測(cè)定:將分離到的菌株接種于NA固體培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)24 h后用無(wú)菌水配成109CFU/mL的菌懸液.分別吸取1 mL菌懸液和1.2中配好的線蟲懸浮液0.5 mL，加入到滅菌的培養(yǎng)皿中，置25℃下培養(yǎng)48 h，然后在體視顯微鏡下檢測(cè)線蟲的死亡率.以1 mL無(wú)菌水加0.5 mL線蟲懸浮液作為對(duì)照，每個(gè)菌株3個(gè)重復(fù).

細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)線蟲的作用測(cè)定:將細(xì)菌菌懸液室內(nèi)離體測(cè)定線蟲校正死亡率達(dá)到80%以上的菌株接種于NA液體培養(yǎng)基中，30℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h后，10000 r/min離心10 min，取上清液.同時(shí)將上清液原液稀釋成2倍液和5倍液，然后分別將上清液原液、上清稀釋液1 mL加入到滅菌的培養(yǎng)皿中，加入0.5 mL配好的線蟲懸浮液，一起放在25℃恒溫箱中培養(yǎng)，分別在24、36和48 h在體視顯微鏡下檢測(cè)并計(jì)算線蟲的死亡率，無(wú)菌水培養(yǎng)作為對(duì)照，3次重復(fù).

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌菌懸液對(duì)線蟲的作用

從蔬菜地?zé)o根結(jié)線蟲土、線蟲衰退土、根結(jié)線蟲土中采集和分離到359株細(xì)菌菌株，有336株菌株在一定程度上表現(xiàn)出殺死南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的能力(以蟲體僵硬，用針觸不動(dòng)的線蟲視為已死亡的線蟲).用109CFU/mL的菌懸液處理幼蟲48 h，線蟲校正死亡率在90%以上有2株菌株，占0.55%;校正死亡率在80% ～90%有7株菌株，占1.95%(表1);校正死亡率在 70% ～80%的有 21株菌株，占5.85%;校正死亡率60% ～70%的有19株菌株，占5.29%.

表1 菌懸液處理48 h南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲室內(nèi)校正死亡率達(dá)到80%以上的菌株Tab.1 Strains which the revised mortality of M.incognita J2 were over 80%in vitro condition after 48 h treatment

2.2 細(xì)菌發(fā)酵液對(duì)線蟲的作用

從表2可以看出，處理后 24、36和48 h后，各發(fā)酵上清液原液及其不同稀釋倍數(shù)液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲均表現(xiàn)出一定的致死作用，且大部分是隨處理時(shí)間而逐漸增強(qiáng)，48 h后有8株菌株的發(fā)酵原液校正死亡率達(dá)到80%以上，其中17號(hào)、119號(hào)、155號(hào)、333號(hào)菌株的發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的校正死亡率均比菌懸液處理高.發(fā)酵液經(jīng)過稀釋后，對(duì)幼蟲的致死作用減弱，稀釋5倍液對(duì)幼蟲的校正死亡率均低于50%，稀釋2倍液還表現(xiàn)出較好的作用，處理48 h有6個(gè)菌株對(duì)幼蟲的校正死亡率仍可達(dá)到50%以上.

表2 生防菌菌株發(fā)酵濾液及其不同稀釋倍數(shù)液對(duì)二齡幼蟲的校正死亡率1)Tab.2 The revised mortality of M.incognita J2 treated with ferment of strains in different concentrations %

3 結(jié)論

本試驗(yàn)從無(wú)根結(jié)線蟲病土壤、根結(jié)線蟲衰退土和根結(jié)線蟲病土3種不同的土壤分離生防細(xì)菌，擴(kuò)大了篩選范圍試驗(yàn).以對(duì)生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害的南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲作為供試線蟲，采用了收取卵塊人工孵化的方式獲取大量根結(jié)線蟲二齡幼蟲進(jìn)行離體測(cè)定，來(lái)衡量生防菌毒力的高低，因在蟲齡、食性等方面差異小，可比性較強(qiáng).

室內(nèi)離體拮抗測(cè)定結(jié)果表明:有336株菌株在一定程度上表現(xiàn)出對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲有致死作用，49株菌株對(duì)南方根結(jié)線蟲的室內(nèi)校正死亡率達(dá)60%以上;從線蟲衰退土中分離到64個(gè)菌株，經(jīng)室內(nèi)毒力測(cè)定，校正死亡率在80%以上的有3個(gè)菌株.說(shuō)明廣西土壤富含大量對(duì)植物寄生線蟲有抗性的根際細(xì)菌，是一類重要的線蟲生防資源，而本地資源相對(duì)引進(jìn)資源更易于定植，因此有待加強(qiáng)研究與開發(fā)利用.

研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，有些菌株的發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲表現(xiàn)出較好的致死作用，效果甚至比菌懸液處理還好，但發(fā)酵上清原液經(jīng)過稀釋后對(duì)幼蟲致死作用均下降，這可能是由于有些細(xì)菌通過產(chǎn)生毒素代謝物或抗生素來(lái)毒殺線蟲，而稀釋后代謝物濃度降低使效果降低，其作用機(jī)制及代謝物的主要成分，還有待進(jìn)一步的研究.

［1］汪來(lái)發(fā)，楊寶君，李傳道.華東地區(qū)根結(jié)線蟲天敵真菌調(diào)查［J］.菌物系統(tǒng)，2001，20(2):264-267.

［2］何勝洋，葛起新.南方根結(jié)線蟲天敵真菌［J］.植物病理學(xué)報(bào)，1987，17(1):14-21.

［3］王明祖，吳秋芳.根結(jié)線蟲卵寄生真菌的研究［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1990，9(3):225-229.

［4］張克勤，高恩 S，巴巴拉 T.根結(jié)線蟲天敵真菌極其高效菌株篩選［J］.真菌學(xué)報(bào)，1993，12(3):240-245.

［5］楊秀娟，何玉仙，陳福如，等.福建省根結(jié)線蟲卵囊真菌的分離與篩選［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2000，15(1):12-15.

［6］祝明亮，奚家勤.云南煙草根結(jié)線蟲拮抗真菌分離鑒定初報(bào)［J］.云南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，26(2):1741-78.