郭建華，李華平，朱紅惠

(1 廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070;2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，廣東廣州 510642）

重金屬對(duì)土壤、水體和大氣的污染已經(jīng)具有廣泛性，并嚴(yán)重危害到社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展.位于粵北的大寶山礦是一座大型多金屬伴生礦床，該礦區(qū)長期粗放采礦，且缺少有效防污措施，使得大量重金屬物質(zhì)匯入橫石河和翁江，已對(duì)礦區(qū)周邊及河流下游生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破壞.據(jù)調(diào)查，受采礦廢水污染的河流內(nèi)，魚蝦絕跡;用污染河水灌溉或受洪泛影響的農(nóng)田，土質(zhì)已被破壞，農(nóng)作物產(chǎn)量劇降甚至絕收.重金屬的污染會(huì)導(dǎo)致土壤中生物種群數(shù)量嚴(yán)重下降，多樣性顯著減少［1］.土壤微生物對(duì)于維持土壤肥力、促進(jìn)植物健康生長，特別是在重金屬污染土壤的生物修復(fù)等方面具有極為重要的作用［2-3］.目前，關(guān)于大寶山重金屬污染區(qū)的土壤微生物種群多樣性以及長期暴露在重金屬環(huán)境中的主要優(yōu)勢種群還缺少研究報(bào)道，而明確這些問題對(duì)于分離篩選重金屬耐受微生物資源，促進(jìn)重金屬抗性微生物資源的保護(hù)和重金屬抗性機(jī)制研究等均具有重要意義.

本研究選用廣東地區(qū)重金屬污染嚴(yán)重的大寶山礦區(qū)土壤，采用分子生態(tài)學(xué)技術(shù)分析了大寶山重金屬污染土壤的微生物多樣性，并進(jìn)一步分析了其優(yōu)勢種群的信息，為篩選生物修復(fù)重金屬污染土壤的微生物菌種提供了依據(jù)，也為該區(qū)域重金屬耐受微生物資源的保護(hù)和開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)信息.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 重金屬污染土壤樣品及未污染土壤樣品采集于廣東大寶山重金屬污染區(qū)與非污染區(qū)(表1).2008年3月在各取樣點(diǎn)取距地表5～10 cm的土壤，編號(hào)并記錄采樣點(diǎn)植被情況，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，土壤樣品經(jīng)風(fēng)干后于4℃保存.采用原子吸收光譜法［4］測定出土壤中重金屬 Cd、Pb、Zn、Cu 的總質(zhì)量比(表1).從測定的樣品中，選取 Cd、Pb、Zn、Cu復(fù)合污染最重的土樣以及上壩癌癥村重金屬污染土樣進(jìn)行DGGE分析.

表1 大寶山重金屬污染土壤樣品特性及重金屬含量測定1)Tab.1 The characteristics and concentration of heavy metals in contaminated soil from Dabaoshan

1.1.2 主要儀器設(shè)備與試劑 DNA純化試劑盒Wizard DNA Clean up system購于美國Promega公司;引物由賽百盛公司合成;Taq DNA聚合酶及其他試劑購于威佳公司;PCR擴(kuò)增儀GeneAmp PCR system 2400，德國PE公司生產(chǎn);變性梯度凝膠電泳儀The DcodeTM Universal Mutation system，美國Bio-Rad公司生產(chǎn);UVI紫外成像系統(tǒng)，英國UVI公司生產(chǎn).

1.1.3 引物 引物(GC-357F:5'－CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG－3';518R:5'－ATT ACC GCG GCT GCT GG － 3')［5］由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成.

1.2 土壤總DNA的提取與純化

采用修改后的 Bead-Beating法［6］.

1.316 S rDNA 的PCR擴(kuò)增

土壤DNA適當(dāng)稀釋后作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(GeneAmp PCR system 2400，PE 公司).使用特異性引物GC-357F和518R對(duì)細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，片段長度約為220～230 bp(包括GC夾子)，PCR反應(yīng)體系(50 μL)組成是10×Buffer(含Mg2+)5 μL，引物 GC-357F 和 518R(10 μmol/L) 各 1 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.25 μL，模板 DNA 2 μL，加去離子水補(bǔ)齊 50 μL.采用降落PCR［7］策略，程序?yàn)?預(yù)變性94 ℃ 5 min，前20 個(gè)循環(huán)為94℃ 30 s，65～55℃ 30 s(其中每個(gè)循環(huán)降低0.5℃)和72℃ 40 s，后10個(gè)循環(huán)為94℃ 30 s，55℃ 30 s和72℃ 40 s，最后72℃延伸20 min，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.4 變性梯度凝膠電泳分析

使用美國Bio-Rad公司的The Dcode Universal Mutation Detection System電泳系統(tǒng)進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE).所用w=8%的聚丙烯酰胺凝膠的變性梯度為35%～65%(100%的變性劑中含有7 mol/L尿素和φ=40%的甲酰胺)，上樣量為50 μL PCR濃縮產(chǎn)物.運(yùn)行條件:1 × TAE［40 mmol/L Tris，40 mmol/L冰乙酸，1.0 mmol/L EDTA(pH8.0)］電泳緩沖液中，恒溫60℃，30 V電泳30 min后，180 V電泳6 h.電泳完畢，用ddH2O漂洗凝膠，再用Gold View染料染色30 min，UVI成像系統(tǒng)拍照.使用 Quantity one V4.6(美國 Bio-Rad公司)軟件對(duì)DGGE電泳圖譜進(jìn)行分析，同時(shí)進(jìn)行UPGMA聚類分析不同樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性.

用Sorenson配對(duì)比較相似性系數(shù)(Pairwise similarity coefficient，Cs)，比較不同樣品DGGE指紋圖譜的相似性［8］:Cs=2j/(a+b).其中 a、b 分別表示2 個(gè)比較對(duì)象中的DNA條帶的數(shù)目，j表示a和b中相同的條帶數(shù)量.

多樣性指數(shù)(H)，物種豐度(S)指標(biāo)被用來比較各個(gè)樣品的細(xì)菌多樣性.公式如下［9］:

其中，pi是某個(gè)樣品中某一條帶的強(qiáng)度在該樣品中所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率，S是某個(gè)樣品中所有條帶數(shù)目的總和，Ni為某一泳道所有條帶的強(qiáng)度總和，N為某一泳道里某一條帶的強(qiáng)度.

1.5 基因克隆和序列分析

從DGGE圖譜中切膠回收優(yōu)勢亮帶，無菌水漂洗2～3次，裝于滅菌的1.5 mL離心管中.加20 μL無菌水浸泡條帶，4℃過夜，離心后取上清作為PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序和體系同1.3，所用引物為357F(不帶GC夾子)和518R.擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收后，采用TaKaRa凝膠回收純化試劑盒進(jìn)行純化.將PCR純化物用TaKaRa pMD18-T Vector進(jìn)行克隆.進(jìn)行藍(lán)白斑篩選后，挑取克隆子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DGGE驗(yàn)證，遷移位置與原始切膠位置一致的克隆送去上海英駿生物技術(shù)有限公司測序.測序結(jié)果經(jīng)NCBI Blast(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行比對(duì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤總DNA提取及16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增

將土壤總DNA抽提物純化后，所得的總DNA片段大小介于18～23 kb，純度較高.以純化后的基因組DNA為模板進(jìn)行V3區(qū)片段擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增出V3區(qū)片段約為230 bp，適用于DGGE分析.

2.2 不同重金屬污染土壤樣品的細(xì)菌種群多樣性及優(yōu)勢條帶分析

對(duì)提取純化的土壤總DNA進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析.從DGGE指紋圖譜(圖1)中可以看出，不同的樣品分離出的條帶不一樣，但是 a、b、c、d、e、f為重金屬污染土樣所共有的優(yōu)勢條帶，而 i、g、h 分別為土樣1、4、14 所特有.這些優(yōu)勢條帶可能是重金屬污染土壤中的優(yōu)勢耐受重金屬種群.DGGE圖譜分析表明，在重金屬復(fù)合污染的土樣中都有明顯的優(yōu)勢條帶，而未污染土壤8和11中沒有明顯的優(yōu)勢條帶.

圖1 提取土壤DNA的16S rDNA V3片段PCR產(chǎn)物的DGGE分析Fig.1 DGGE analysis of 16S rDNA V3 fragments of PCR products amplified from soil-DNA extracts

圖2可以看出，土樣6、8、11的生物多樣性指數(shù)和物種豐度均較高，而土樣3、7、14的數(shù)值相對(duì)較低.6號(hào)土樣為Cd污染最重的土樣，其多樣性指數(shù)為2.36，從該土壤的DGGE圖譜(圖1)上看其有優(yōu)勢條帶較其他土樣多，且總條帶數(shù)為16條，其物種豐度較高.該土樣的地表植物為香根草 Vetiveria zizanioides，而香根草為重金屬積累植物.這表明，土壤根際植物以及土壤特性對(duì)微生物多樣性具有一定的影響.未污染土樣8和11的生物多樣性指數(shù)分別為2.39和2.56，總條帶數(shù)都是16條，但其優(yōu)勢條帶較少.

圖2 大寶山重金屬污染土壤微生物多樣性及物種豐度分析Fig.2 Analysis of microbial diversity and abundance of heavy metal-contaminated soil in Dabaoshan

DGGE條帶聚類分析(圖3)表明，土樣3、4、5聚在一起，相似性為45%以上.土樣8、11、12聚在一起，相似性為58%.土樣15、9聚在一起，相似性達(dá)到86%，土樣10、13相似性為87%.結(jié)果表明，相同生境的土壤樣品可以聚到一起，復(fù)合重金屬污染較重的土樣基本聚在一起，相似性為38%，而采集于上壩癌癥村的土樣也可以聚在一起，相似性為43%.

圖3 大寶山重金屬污染土壤微生物DGGE條帶聚類分析Fig.3 Dendrogram showed the microbial community of heavy metal-contaminated soil in Dabaoshan by DGGE patterns analysis

2.3 優(yōu)勢種群的分析

對(duì)指紋圖譜(圖1)中優(yōu)勢條帶(共有條帶a、b、c、d、e、f，差異條帶 g、h、i)進(jìn)行了克隆測序.測序結(jié)果經(jīng)NCBI Blast比對(duì)分析(表2)，其中大部分為未培養(yǎng)細(xì)菌的16S rDNA V3區(qū)片段.主要優(yōu)勢菌群為未培養(yǎng)的α-變形菌綱alpha Proteobacterium、勞爾氏菌屬 Ralstonia、酸桿菌門 Acidobacteria、放線菌屬Actinobacterium，以及產(chǎn)卟啉菌屬 Porphyrobacter、Pseudochrobactrum、無色桿菌屬Achromobacter和鏈霉菌屬Streptomyces.

優(yōu)勢種群分析表明，復(fù)合重金屬污染較重的土壤中，未培養(yǎng)的勞爾氏菌屬、Achromobacter xylosoxidans、未培養(yǎng)的 α-變形菌綱、Pseudochrobactrum 是占優(yōu)勢的種群.未培養(yǎng)的酸桿菌門為Cu污染最重的1號(hào)土樣中的特有優(yōu)勢種群;鏈霉菌屬為Pb污染最重的4號(hào)土樣中的優(yōu)勢種群;未培養(yǎng)的放線菌屬為14號(hào)土樣中的優(yōu)勢種群.

表2 測序克隆序列與其GenBank最相似序列的比對(duì)結(jié)果Tab.2 Alignment of sequenced clone to its most-similar GenBank sequence

3 討論

目前，國內(nèi)對(duì)于該礦區(qū)的細(xì)菌多樣性及優(yōu)勢種群的研究鮮見報(bào)道，對(duì)該地區(qū)已有的研究主要是關(guān)于土壤中重金屬特性以及生態(tài)退化的現(xiàn)狀，水體重金屬污染的評(píng)價(jià)和相關(guān)治理途徑的探討等方面［10-13］.本研究結(jié)果表明，重金屬嚴(yán)重影響了微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，重金屬污染的脅迫導(dǎo)致了微生物群落多樣性的減少，優(yōu)勢種群數(shù)量增多.重金屬污染土壤與未污染土壤相比較，在微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性以及物種豐度、優(yōu)勢種群方面都發(fā)生了明顯改變，其DGGE指紋圖譜中的總條帶數(shù)目以及優(yōu)勢條帶都有明顯差異，微生物多樣性也明顯減少，出現(xiàn)優(yōu)勢種群.這說明重金屬污染的脅迫會(huì)促使某些在沒有污染脅迫的土壤中不占優(yōu)勢的微生物種類成為優(yōu)勢種群，而這些微生物可能具有某些特殊功能，能夠耐受重金屬脅迫.這可能是一定程度的重金屬污染改變了原有群落內(nèi)部種群之間的競爭關(guān)系，導(dǎo)致原始優(yōu)勢種群失去了優(yōu)勢作用，或者是一部分微生物產(chǎn)生的重金屬抗性保護(hù)了其他種群的微生物，從而使重金屬污染土壤的優(yōu)勢種群發(fā)生了明顯改變.長期生活在富含重金屬環(huán)境中的微生物群體對(duì)重金屬形成了一定的耐性和抗性，從而成為重金屬污染環(huán)境中的優(yōu)勢種群［14］.因此，污染土壤中的優(yōu)勢種群一般為重金屬耐受菌［15］.

此外，本試驗(yàn)也表明，污染土壤的微生物群落多樣性又不簡單地隨重金屬污染程度增大而減少，這與Smit等［16］報(bào)道不一致.6號(hào)土樣為Cd污染較嚴(yán)重，但是從指紋圖譜上可以看出，此樣品分離條帶較多.其原因可能是兩個(gè)方面:一是和土壤的特性有關(guān).例如土壤pH與細(xì)菌群體生物量成正相關(guān).并且，pH可以影響土壤重金屬的生物有效性［17-18］.不同的土壤pH，使土壤生境有較大差異;二是植物的種類多樣性影響土壤微生物的多樣性和種群結(jié)構(gòu).本研究各個(gè)采樣點(diǎn)的植被不相同，一些植物為重金屬超積累植物，如空心蓮子草Alternanthera philoxeroides根、莖、葉中Zn的含量可高達(dá)1699.28、1108.77和753.08 mg/kg;香根草Vetiveria zizanioides的莖葉對(duì)Cd、Ni、Pb等存在不同程度的富集性，可以承受非常嚴(yán)重的重金屬污染和很強(qiáng)的毒性條件，其承受閥值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他植物［19］.一些陸生蕨類植物能從環(huán)境中蓄積大量的重金屬.這些重金屬積累植物，改變了微生物的生境，使微生物多樣性指數(shù)及生物豐度高.同時(shí)，本研究結(jié)果也顯示:同樣的植被，微生物區(qū)系和多樣性卻完全不同，如樣品1～5號(hào)，植被都是蕨類植物，但是土壤微生物的優(yōu)勢種群和多樣性卻有差異，其原因可能是這些蕨類植物生長年限短，對(duì)土壤中微生物種群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用還未有顯現(xiàn).再者，1～6號(hào)是來源于不同地點(diǎn)的土壤樣品，土壤樣品特性復(fù)雜且影響因素多，對(duì)微生物種群的影響就更為復(fù)雜.

本研究通過對(duì)土壤微生物群落的分析及對(duì)優(yōu)勢條帶克隆測序，發(fā)現(xiàn)大寶山重金屬污染土壤中的優(yōu)勢菌大多是未培養(yǎng)菌，其主要菌群為未培養(yǎng)的α-變形菌綱、勞爾氏菌屬、酸桿菌門 和放線菌屬，以及產(chǎn)卟啉菌屬、Pseudochrobactrum、無色桿菌屬和鏈霉菌屬.這些優(yōu)勢種群的種屬信息為下一步從重金屬污染土壤中分離篩選耐受重金屬脅迫的微生物菌種提供了一定的科學(xué)依據(jù).從而可以更有針對(duì)性地設(shè)計(jì)分離培養(yǎng)基，更快、更準(zhǔn)確地篩選到土壤中占優(yōu)勢的耐受重金屬污染脅迫的微生物菌種資源，用于重金屬污染的修復(fù).Hu Qing等［20］通過PCR-DGGE對(duì)Pb-Zn尾礦的微生物群落分析，對(duì)主要優(yōu)勢菌群測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)特殊的選擇性培養(yǎng)基，分離到2個(gè)耐Cd的細(xì)菌Bacillus cereus和 Enterobacter cloaca.但同時(shí)對(duì)于未培養(yǎng)菌的分離也是一個(gè)難點(diǎn)，未培養(yǎng)微生物大多是因?yàn)榕囵B(yǎng)方法和培養(yǎng)條件的限制，使得目前還無法培養(yǎng)，設(shè)計(jì)特殊的培養(yǎng)基、尋找合適的培養(yǎng)條件來培養(yǎng)采用常規(guī)方法無法培養(yǎng)的微生物，是未來的發(fā)展方向和研究熱點(diǎn).

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