李桂君 宋嘉隆 吳 捷

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所森林培育室,哈爾濱 150080)

興安石竹莖段離體繁殖的研究

李桂君 宋嘉隆 吳 捷

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所森林培育室,哈爾濱 150080)

以興安石竹單節(jié)莖段為試材進(jìn)行離體培養(yǎng),通過(guò)腋芽增值途徑產(chǎn)生再生植株,篩選出了較適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,繼代增值培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基,建立了完整的組織培養(yǎng)快繁體系。

興安石竹;莖段離體培養(yǎng);腋芽增殖

興安石竹 (Gypsophila davuricaTurczex)自然分布于東北內(nèi)蒙古的草原、丘陵、固定沙丘及石礫質(zhì)山坡地帶[1,2]為多年生宿根草本植物,植株高約 20～30cm,莖節(jié)明顯,葉狹長(zhǎng),對(duì)生于莖節(jié)處,花為粉色或紫色,花朵繁茂艷麗,莖葉潔凈翠綠十分美觀,可在園林綠化中廣范應(yīng)用。同時(shí)它又是花卉育種的良好原始材料,花卉栽培品種中十分流行的康乃馨 (香石竹)和常夏石竹 (地被石竹)均是它的近親。興安石竹的根含皂苷可入藥,性味歸經(jīng),味甘,性微寒,有逐水利尿之功效,用于水腫脹滿、胸肋滿悶、小便不利等有顯著效果。興安石竹雖然分布較廣,但多呈零星散生狀態(tài),無(wú)大面積集中分布,因而資源總量不多。加上在園林和醫(yī)藥上的應(yīng)用價(jià)值,常常被人們采挖。其資源已明顯日趨減少。若不采取措施加以保護(hù),資源會(huì)日漸枯竭。興安石竹扦插不易生根,研究其組培技術(shù)并建立可行的快繁體系,對(duì)于擴(kuò)大種群數(shù)量,發(fā)揮其在遺傳育種、園林栽培、醫(yī)藥等方面的重要作用并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用都有十分重要的意義。迄今,興安石竹組織離體培養(yǎng)方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料和方法

6月上旬植株開(kāi)始旺盛生長(zhǎng)時(shí),采下健康的嫩莖作為實(shí)驗(yàn)材料。實(shí)驗(yàn)材料先用水洗去表面的灰塵,從節(jié)間處剪成帶葉的莖段和帶葉的頂梢。為了實(shí)驗(yàn)材料一致和方便,本實(shí)驗(yàn)主要使用莖段,僅用少數(shù)頂梢作為對(duì)比觀察。若葉片較長(zhǎng)可將葉片前端的三分之一剪掉,將留下的材料放入清水中,滴入幾滴洗滌劑搖動(dòng)片刻,用自來(lái)水沖去泡沫后,再換水 4～5次將材料洗凈,然后將材料浸入次氯酸鈣的飽和水溶液中,蓋緊瓶塞滅菌 15～18min,其間不時(shí)搖動(dòng)。滅菌完畢后在超凈工作臺(tái)內(nèi)倒掉消毒液,用無(wú)菌水沖洗 5遍,取出,用無(wú)菌濾紙將材料表面多余的水分吸干后備用。

接種時(shí)先用手術(shù)刀將材料的剪口部位切去,用長(zhǎng)鑷子夾取材料并將其直接插入培養(yǎng)基約 0.8～1.0cm并使其保持直立,每個(gè)培養(yǎng)基組合接 6瓶,每瓶接種材料 5個(gè),接種后一周內(nèi)及時(shí)觀察雜菌污染情況,若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)發(fā)生污染立即把未污染的材料轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基或重新接種補(bǔ)齊。接種分別使用MS、H和 WH ITE三種基本培養(yǎng)基,補(bǔ)加0.5～2.0(單位:mg/L下同)的 6-芐基嘌呤 (BA)或1.0的 6-呋喃氨基嘌呤 (KT),0.05的α-萘乙酸 (NAA)和 1%～4%的蔗糖,為了便于單因子比較培養(yǎng)基組合詳見(jiàn)表1。

繼帶增殖使用的培養(yǎng)基為:MS+BA0.5+NAA0.02+2%蔗糖和WH ITE+BA0.5+NAA0.02+2%蔗糖。

生根培養(yǎng)基按表2配制,其組成成分見(jiàn)表2。

培養(yǎng)基配完后加 0.6%的瓊脂粉,溶化后用0.1N的NaOH將 pH調(diào)至5.8分裝后在1kg/cm2條件下熱壓滅菌20min。

接種后的材料置于架上光照培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)晝夜溫度變化于 20～25℃,白天補(bǔ)充日光燈照明 14h,光強(qiáng)度 2000ix。

試管苗移栽采用珍珠巖、蛭石、沙壤土三種基質(zhì)。

2 結(jié)果和討論

2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)

材料接種后約一周,對(duì)生的腋芽開(kāi)始膨脹。再經(jīng) 5～6d腋芽開(kāi)裂從一側(cè)或兩側(cè)同時(shí)長(zhǎng)出新的幼芽。接種后 20d新芽進(jìn)入正常生長(zhǎng)階段。部分材料由于太過(guò)細(xì)弱或由于滅菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使外植體受到藥害,逐漸黃化枯萎。接種后 25d時(shí)調(diào)查材料生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。

表1興安石竹單節(jié)莖段在不同培養(yǎng)基組合中的誘導(dǎo)情況(接種后 25d調(diào)查)

在以MS為基本培養(yǎng)基的組合中,以 BA1.0+NAA0.05和 2%蔗糖的 2號(hào)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況最好,誘導(dǎo)率高達(dá)82.72%,BA的濃度為2.0和 0.5時(shí)誘導(dǎo)率分別下降為76.77%和60.00%……。在用KT1.0取代BA1.0的 4號(hào)培養(yǎng)基中,誘導(dǎo)率為74.87%,說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)條件下,KT的效果不及 BA。因此,激素的合理使用對(duì)誘導(dǎo)效果有重要作用[3,4]。若仍采用較優(yōu)的 2號(hào)培養(yǎng)基的激素組合,而只將蔗糖濃度調(diào)整到 1%和 4%,誘導(dǎo)率則分別下降到56.67%和30.00%,這說(shuō)明在興安石竹的莖段培養(yǎng)中,蔗糖濃度不宜偏高或偏低,蔗糖濃度為 4%時(shí)的誘導(dǎo)率較 2%時(shí)降低幅度達(dá)52.72%,所以,較高的蔗糖濃度尤其不宜。

從同時(shí)進(jìn)行的 7號(hào)和 8號(hào)培養(yǎng)基組合來(lái)看,無(wú)機(jī)鹽總量中等的 H培養(yǎng)基和無(wú)機(jī)鹽總量偏低的WH ITE培養(yǎng)基,其誘導(dǎo)率分別為72.41%和46.43%,均低于有同樣附加成分的MS培養(yǎng)基?？磥?lái),在興安石竹莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)階段,仍以無(wú)機(jī)鹽總量偏高的MS效果為好,無(wú)機(jī)鹽總量偏低的WH ITE培養(yǎng)基其誘導(dǎo)效果最差。

2.2 繼代增殖

當(dāng)材料長(zhǎng)到 3～4cm高時(shí),可從節(jié)間處將其剪成單節(jié)莖段,轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖。繼代培養(yǎng)采用 MS和WH ITE兩種基本培養(yǎng)基,由于此時(shí)試管苗內(nèi)的激素成分已有所積累,故將 BA和 NAA濃度分別降至0.5～0.02。這時(shí)的材料已完全適應(yīng)培養(yǎng)基的條件且處在旺盛生長(zhǎng)期,無(wú)論是頂梢還是中段,生長(zhǎng)速度和增殖速度都很快,30～40d即可布滿整個(gè)培養(yǎng)瓶。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),從兩種繼代增殖培養(yǎng)基的效果看,MS培養(yǎng)基好于WH ITE培養(yǎng)基,可能是后者因無(wú)機(jī)鹽含量低,營(yíng)養(yǎng)條件不足所致。經(jīng)統(tǒng)計(jì),此階段試驗(yàn)材料的月增殖系數(shù)可達(dá)到4.5～5.0甚至更高,完全能夠滿足建立快繁體系的要求。

2.3 誘導(dǎo)無(wú)根苗生根

將繼代增殖的材料從節(jié)間處剪成雙節(jié)莖段扦插在生根培養(yǎng)基中,15～18d莖基部開(kāi)始生根,第25d調(diào)查的生根情況見(jiàn)表2。

表2 興安石竹無(wú)根試管苗在生根培養(yǎng)基中的生根情況(轉(zhuǎn)瓶后 25d調(diào)查)

從表2可以看出,不同培養(yǎng)基組合,其生根率有明顯差別,在激素相同的情況下,MS(半)的生根率高于MS培養(yǎng)基。這表明在生根階段適當(dāng)降低培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽濃度有利于生根,這與其他作者的結(jié)果一致[5,1]。而基本培養(yǎng)基同為MS(半),NAA、 IAA和 IBA也同為0.5時(shí),其生根率分別為 88%、80%和 84%。使用 NAA者生根率最高,但根較細(xì)弱,且莖基部有少量組織;使用 IAA時(shí),生根率較低,但根較長(zhǎng),莖基部無(wú)愈傷組織;而使用 IBA者,生根率較使用 NAA時(shí)略低,但根較粗壯,且莖基部無(wú)愈傷組織。三者綜合比較,使用 IBA者根較健康,且莖基部無(wú)愈傷組織產(chǎn)生,因此效果最好。

2.4 試管植株移栽

試管植株生根后,增加自然光照強(qiáng)度,使其更加健壯,當(dāng)根生長(zhǎng)至1.5～2.5cm長(zhǎng)時(shí)移栽效果最好。此時(shí)可去掉瓶塞,練苗 3～4d備用。

移苗基質(zhì)為珍珠巖、蛭石和壤土加沙土 (1∶1),但后者事先經(jīng)過(guò)了消毒處理,以防雜菌污染。栽苗的容器采用小號(hào)營(yíng)養(yǎng)杯或植苗盤(pán)。

移栽時(shí),仔細(xì)取出瓶苗,用清水洗去根部的培養(yǎng)莖,勿傷根系,移后,覆好基質(zhì),壓實(shí),澆足水,置于光線充足又無(wú)陽(yáng)光直射處緩苗。在幼苗上方覆以塑料膜保持空氣濕度,每天適量噴水并適時(shí)打開(kāi)塑料膜通風(fēng)換氣,隔日用 1%～3%波爾多液噴霧,防止病害發(fā)生,1個(gè)月后去掉塑料膜進(jìn)入正常管理。經(jīng)調(diào)查,首批移栽入珍珠巖、蛭石和沙壤土中的試管菌成活率分別為85.00%、90.00%和81.67%。

興安石竹試管植株移栽時(shí),有兩個(gè)問(wèn)題值得注意:一是試管植株本身具有完整根系,植株健康;二是移栽條件要有保障,基質(zhì)溫度 23～25℃;基質(zhì) (土壤)含水量 16%～18%,水分不宜過(guò)大;空氣相對(duì)濕度 65%～70%。只要滿足上述條件,移栽成活率可達(dá) 90%以上。

已有不少研究證實(shí),利用腋芽增殖,產(chǎn)生的再生植株在遺傳上相對(duì)穩(wěn)定,因此這一途徑已在不少植物的快繁上得到了應(yīng)用。

3 小結(jié)

(1)在誘導(dǎo)培養(yǎng)初期,以 MS+BA1.0+NAA0.05+2%蔗糖效果最好,誘導(dǎo)率達(dá) 82.72%。

(2)在繼代增殖階段,以 MS+BA0.5+NAA0.02+2%蔗糖效果最好,月增殖系數(shù)可達(dá) 4.5～5.0。

(3)在誘導(dǎo)無(wú)根苗生根時(shí),以 MS(半)+ IBA0.5+1%蔗糖效果最好,生根率可達(dá) 84%,且根的狀態(tài)良好。

(4)以蛭石為基質(zhì),控制好移栽條件,移栽成活率可達(dá)90%。

[1]周以良.黑龍江省樹(shù)木志[M].哈爾濱:黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社,1986.

[2]周以良.黑龍江植物志[M].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué)出版社,2003.

[3]卷曉峰.不同激素水平對(duì)西瓜、麗格秋海棠試管苗誘導(dǎo)的影響[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技,2008,(5).

[4]馮健,蘇麗娜.長(zhǎng)白山百合的離體快繁技術(shù)研究[J].北方園藝,2009,(4).

[5]朱自清.植物細(xì)胞工程 [M].北京:化學(xué)出版社,2003.

S681.5

A

1674-6341(2010)02-0018-02

2010-02-08

黑龍江省重點(diǎn)科技項(xiàng)目資助《黑龍江省森林漿果資源高效栽培及加工技術(shù)的研究》(編號(hào):GB06B306-2)

李桂君 (1963-),女,黑龍江哈爾濱人,副研究員,從事森林培育研究。

責(zé)任編輯:王洪軍