虞 淼,吳淑春

(1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,浙江杭州 310020; 2.浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,浙江杭州 310053)

食品中性激素多組分殘留分析方法的概述

虞 淼1,吳淑春2

(1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心,浙江杭州 310020; 2.浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,浙江杭州 310053)

綜述了最近報(bào)道的關(guān)于應(yīng)用色譜法檢測(cè)食品中性激素多組分殘留的分析方法。首先對(duì)性激素作簡(jiǎn)短的介紹,然后著重概述了性激素多組分殘留的分析方法,包括樣品的提取、純化和各種不同的檢測(cè)方法,并對(duì)各種不同的分析方法進(jìn)行詳細(xì)闡述。最后總結(jié)了性激素多組分殘留檢測(cè)方法的發(fā)展趨勢(shì)。

性激素,多組分殘留,分析方法

2 性激素多組分殘留檢測(cè)方法

在一定范圍內(nèi),性激素作為獸藥使用在法律上是允許的,但作為動(dòng)物的生長(zhǎng)促進(jìn)物質(zhì)是被嚴(yán)格禁止的。近年來(lái),人們又把目光投向了食品中性激素的殘留情況,包括各種肉制品,動(dòng)物內(nèi)臟,乳制品等。因此,就需要有不斷發(fā)展的關(guān)于性激素多組分殘留的檢測(cè)方法。同時(shí)由于食品中性激素的痕量殘留(ng～μg·kg-1)和食品基質(zhì)本身的復(fù)雜性,這就要求這些檢測(cè)方法不但要具有很高的靈敏度,并且要具有相應(yīng)合適的性激素殘留的提取和純化方法。

從報(bào)道的文獻(xiàn)來(lái)看,主要還是集中在肉制品中性激素多組分殘留的分析檢測(cè),并出現(xiàn)了一系列關(guān)于肉制品中性激素多組分殘留檢測(cè)的方法[4-8,10]。但是對(duì)于腎臟、肝臟和乳制品[11]中的性激素多組分殘留檢測(cè)方法的報(bào)道較少。

2.1 樣品的提取和純化

由于食品樣品基質(zhì)的復(fù)雜性和性激素的痕量殘留 (ng～μg·kg-1),以及樣品提取和純化過(guò)程的復(fù)雜性,導(dǎo)致很多相應(yīng)的檢測(cè)方法最后的回收率較低,這樣也使得食品中性激素多組分殘留的檢測(cè)變得很具有挑戰(zhàn)性。

一般來(lái)說(shuō),固體樣品(如腎臟、肝臟)先經(jīng)粉碎或冷凍干燥或均質(zhì)化后,再經(jīng)有機(jī)溶劑提取,然后應(yīng)用各種方法進(jìn)行一系列的純化,如液液萃取 (LLE)、固相萃取(SPE)等。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,固相萃取是性激素純化過(guò)程中最常用的手段[6,8,10,12]。另外,也有報(bào)道其他的新方法如超臨界流體萃取 (SFE)在性激素提取純化過(guò)程中的應(yīng)用[13,17]。

目前很多關(guān)于性激素殘留檢測(cè)方法都是針對(duì)食品中游離態(tài)性激素的。對(duì)于結(jié)合態(tài)的性激素,一般在樣品的處理過(guò)程中先使用 Helix pomatia液(含有β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶)[5,7-8,10]等酶解液對(duì)樣品進(jìn)行水解,不過(guò)由于動(dòng)物組織中結(jié)合態(tài)性激素可以被酶解的部分含量很低,因此使用 Helix pomatia液對(duì)樣品進(jìn)行水解的有效性還存在很大的爭(zhēng)議。Har tmann和Steinhart[15]對(duì)使用酶解液進(jìn)行酶解過(guò)程中性激素結(jié)構(gòu)變化的可能性進(jìn)行了討論,如孕烯醇酮轉(zhuǎn)變成孕酮。

最近的研究表明,動(dòng)物組織中性激素的提取一般都使用甲醇作為提取劑[4,6,8],然而,Fuh[12]和Blasco[10]等指出使用乙腈作為提取劑能得到更純的提取物。Daeseleire[5]等在提取過(guò)程中則使用二乙醚作為提取劑。

對(duì)一個(gè)分析方法來(lái)說(shuō),粗提物的純化很關(guān)鍵,因?yàn)樗苯雨P(guān)系到最后目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)。從表 1中可以看出,SPE過(guò)程用到的吸附劑一般是 C8、Si-NH2、C18,通過(guò)使用這些特定的吸附劑,可以把不同性質(zhì)的性激素一一分離[8,16]。

2.2 幾種先進(jìn)的提取和純化技術(shù)

前面 2.1中提到的方法通常比較耗時(shí)、費(fèi)力,同時(shí)需要大量的有機(jī)試劑,并且這些方法只能針對(duì)同一類或幾小類性激素的分析,因此,在這里介紹幾種可能用到的新的提取純化技術(shù)。

表1 GC-MS檢測(cè)樣品中性激素多組分殘留的方法

加速溶劑萃取 (ASE),也叫加壓液體萃取(PLE),它是一種在高溫高壓下對(duì)固體樣品提取的技術(shù),該方法在環(huán)境化學(xué)和食品分析中應(yīng)用較廣泛。這個(gè)方法最大的優(yōu)點(diǎn)就是能減少試劑的用量和加快提取過(guò)程。雖然這是一項(xiàng)很有前途的技術(shù),但在性激素多組分殘留分析過(guò)程中很少應(yīng)用,幾乎未見(jiàn)有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

超臨界流體萃取(SFE),跟索氏提取法類似的一項(xiàng)技術(shù),區(qū)別是提取過(guò)程中使用超臨界流體作為溶劑,最常用的超臨界流體是二氧化碳[13,17]。這項(xiàng)技術(shù)的最主要優(yōu)點(diǎn)是高擴(kuò)散率、低粘度和較小的表面張力。但關(guān)于在性激素殘留檢測(cè)過(guò)程中使用該技術(shù)的報(bào)道很少,就本人掌握的文獻(xiàn)有：Din[18]等使用該技術(shù)提取牛肉中的群勃龍;Huopalahti和 Henion[19]應(yīng)用該技術(shù)對(duì)牛組織中七種雌激素進(jìn)行提取。值得一提的是,該項(xiàng)技術(shù)目前還主要針對(duì)環(huán)境化學(xué)領(lǐng)域,而不是食品中痕量性激素殘留的分析。

固相微萃取(SP ME),該項(xiàng)技術(shù)的原理是利用被分析組分在樣品基質(zhì)與提取劑中的分配不同,從而達(dá)到分離目的[17]。Ridgway[20]等提到,和溶劑提取相比,SP ME具有能減少溶劑的使用、同步完成提取、凈化和濃縮過(guò)程以及在樣品量很小的情況下也能處理等優(yōu)勢(shì)。然而,到目前為止很少有關(guān)于該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物源固體食品中性激素提取的報(bào)道。

微波輔助提取 (MAE),它利用提取過(guò)程中對(duì)固體樣品的攪動(dòng)和加熱從而提高提取的效率。由于它能縮短提取時(shí)間和減少試劑用量,因此比索氏提取更具有優(yōu)勢(shì)。這項(xiàng)技術(shù)在環(huán)境樣品中應(yīng)用很廣泛,比如從環(huán)境樣品中提取性激素、除草劑、苯酚、多環(huán)芳烴和多氯聯(lián)苯[21],但是還沒(méi)有關(guān)于該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于食品中性激素提取的報(bào)道。Her mo等[22]利用該項(xiàng)技術(shù)對(duì)豬肉中的喹諾酮?dú)埩暨M(jìn)行了提取。

2.3 性激素的檢測(cè)方法

過(guò)去的幾年中,主要是利用色譜 (GC或 LC)聯(lián)用高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng),比如MS,對(duì)食品中性激素多組分殘留進(jìn)行檢測(cè),其中,又以 GC-MS或 GC-MS -MS(氣相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜)應(yīng)用最廣泛。然而,近年來(lái),LC-MS(液相色譜-質(zhì)譜)在性激素多組分殘留檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。這些色譜技術(shù)已經(jīng)慢慢取代了原來(lái)的免疫法和薄層色譜法。

在過(guò)去,對(duì)于一些性激素的檢測(cè)主要是利用放射免疫法(R IA)和酶聯(lián)免疫法 (EL ISA)。如今,由于這些方法本身的局限性,如低靈敏度、不能滿足質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的要求,應(yīng)用已經(jīng)越來(lái)越少了。而 GC和LC由于它們的高靈敏度、高特異性,已經(jīng)慢慢取代了上述方法。只有在一些特定物質(zhì)的檢測(cè)上,如α-或β-群勃龍,依舊會(huì)用到高效薄層色譜(HPT LC)。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,對(duì)于食品中性激素多組分殘留的分離和檢測(cè)最常用的技術(shù)就是氣相色譜串聯(lián)一級(jí)或多級(jí)質(zhì)譜[MS(-MS)]。但是由于性激素本身的熱不穩(wěn)定性和不易揮發(fā)性,因此在用氣相色譜檢測(cè)時(shí),需要對(duì)性激素進(jìn)行衍生化。從文獻(xiàn)中可以發(fā)現(xiàn),對(duì)于性激素的衍生化,主要是利用各種不同衍生化試劑或衍生化試劑結(jié)合一系列催化劑對(duì)性激素分子結(jié)構(gòu)中的羥基和/或酮基進(jìn)行衍生化。幾乎所有的文獻(xiàn)中都提到了利用MSTFA(N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺)作為硅烷化衍生試劑,另外MSTFA+NH4I或MSTFA+T MSI或MSTFA+T M IS+DTE作為衍生化試劑同樣具有很好的效果[6,23-24],其中 NH4I、T MSI、T M IS等是作為催化劑的。Seo等[9]使用MSTFA+二硫赤蘚糖醇(DTE)+NH4I作為混合衍生試劑,這里DTE作為抗氧化劑。

如今,高效液相色譜串聯(lián)各種高靈敏度的檢測(cè)系統(tǒng)在性激素多組分殘留的分析中應(yīng)用越來(lái)越廣泛,它具有高選擇性、高靈敏度和高特異性,最重要的是使用該技術(shù),樣品不需經(jīng)衍生化。此外,由于缺乏一種能對(duì)各種性激素都有效的普遍使用的衍生化試劑,也促進(jìn)了各種基于液相色譜檢測(cè)性激素方法的發(fā)展,然而,各種檢測(cè)性激素殘留的 LC-MS方法都是針對(duì)環(huán)境樣品[25]或尿樣[26]的,相比與 GC-MS,應(yīng)用 LC-MS檢測(cè)動(dòng)物源食品中性激素殘留的很少[10,14,27],主要應(yīng)用在檢測(cè)群勃龍類 (熱不穩(wěn)定性)和康力龍(氣相色譜對(duì)其結(jié)構(gòu)中的吡唑環(huán)具有強(qiáng)吸收)等性激素。另外,LC串聯(lián)各種MS(如離子阱或飛行時(shí)間質(zhì)譜儀)技術(shù)使得分析檢測(cè)新的未知性激素成為可能,這些技術(shù)有望在未來(lái)幾年內(nèi)更多地應(yīng)用到食品中性激素多組分殘留的檢測(cè)中去。

3 結(jié)論

如今,由于生產(chǎn)方面的需要,更多的牲畜養(yǎng)殖戶會(huì)在養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中多多少少使用一些合法的或違禁的藥物來(lái)促進(jìn)牲畜的生長(zhǎng),而一些食品生產(chǎn)廠家為了獲取更多的經(jīng)濟(jì)利益,也會(huì)在生產(chǎn)加工過(guò)程中添加一些添加劑,在這些藥物和添加劑當(dāng)中也包括了各種性激素。由于好多藥物和添加劑的使用是受國(guó)家或國(guó)際上的相關(guān)法律法規(guī)嚴(yán)格控制的,因此有關(guān)方面也出臺(tái)了很多關(guān)于食品中性激素多組分殘留的檢測(cè)方法。

總體來(lái)說(shuō),在食品中性激素多組分殘留的檢測(cè)中,固相萃取以及 GC-MS應(yīng)用最廣泛,然而,如今更多的焦點(diǎn)轉(zhuǎn)到了使用 LC-MS進(jìn)行分析檢測(cè)。除此之外,更多尖端的提取純化技術(shù)和檢測(cè)技術(shù)也不斷發(fā)展起來(lái),如超臨界流體萃取技術(shù)、飛行時(shí)間質(zhì)譜儀等。而另外一些技術(shù),如加速溶劑萃取、選擇性吸附劑等,由于新的性激素不斷出現(xiàn),并且相關(guān)的設(shè)備很昂貴,則在性激素殘留分析中的使用受到越來(lái)越多的限制。

目前我國(guó)的食品安全狀況不容樂(lè)觀,最近的毒奶粉事件也反映出了我國(guó)在一些檢測(cè)技術(shù)和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)上的滯后。而如今食品中性激素殘留的情況很普遍,雖然國(guó)家出臺(tái)了各種政策法規(guī)來(lái)遏制性激素進(jìn)入飼養(yǎng)業(yè)而對(duì)人體造成危害,但各種違禁藥物還是屢禁不止。這主要是我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)體系不夠健全,而且現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定目標(biāo)單一,檢測(cè)效率低下,檢測(cè)成本較大;另外我國(guó)的畜牧業(yè)生產(chǎn)大多數(shù)是以家庭飼養(yǎng)為主,飼養(yǎng)農(nóng)戶大多數(shù)使用自己配制的飼料進(jìn)行喂養(yǎng),添加違禁藥物的行為很隱蔽,難以從飼料源頭進(jìn)行控制。因此,探索一些高效快速的性激素多殘留檢測(cè)方法對(duì)食品安全質(zhì)量控制、檢測(cè)效率的提高,以及檢測(cè)成本的降低具有重要的實(shí)際意義,同時(shí)對(duì)改善我國(guó)食品安全的狀況具有重要意義。

[1]StubbingsG W, Cooper AD, Shepherd MJ, etal. Determination of 19-nortestosterone and trenbolone in animal tissues by high-perfor mance liquid chromatography with immunoaffinity clean-up[J].Food Addit Contam,1998,15(3)：293-301.

[2]Sadao Nakamura,Tan Hwee Sian,Shigeki Daishima. Determination of estrogens in riverwater by gas chromatographynegative-ion chemical-ionization mass spectrometry[J].J ChromatogrA,2001,919：275-282.

[3]崔曉亮,邵兵,趙榕,等 .超高效液相色譜-串聯(lián)電噴霧四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中 12種糖皮質(zhì)激素的殘留[J].色譜,2006,24(3)：213-217.

[4]Hartmann S,H Steinhart.Simultaneous determination of anabolic and catabolic steroid hormones in meatby gas chromatography-mass spectrometry[J].ChromatogrBiomedAppl, 1998,704：105-117.

[5]Daeseleire E,Vandeputte R,Van Peteghem C.Validation of multi-residue methods for the detection of anabolic steroids by GC-MS in muscle tissues and urine samples from cattle[J]. Analyst,1998,123(12)：2595-2598.

[6] Impens S,De Wasch K,Cornelis M,et al.Analysis on residues of estrogens,gestagens and androgens in kidney fat and meatwith gas chromatography-tandem mass spectrometry[J].J ChromatogrA,2002,970：235-247.

[7]湛嘉,李佐卿,俞雪鈞,等 .豬肉中 16種性激素的多殘留檢測(cè)方法[J].寧波大學(xué)學(xué)報(bào)：理工版,2007,20(4)：520-525.

[8]Marchand P,B Le Bizec,C Gade,et al.Ultra trace detection of a wide range of anabolic steroids in meat by gas chromatography coupled to mass spectrometry[J].J Chromatogr A,2000,867：219-233.

[9]Seo J,H Kim,B C Chung,et al.Simultaneous determination of anabolic steroids and synthetic hormones in meat by freezinglipid filtration,solid-phase extraction and gas chromatographymass spectrometry[J].J ChromatogrA,2005：1067：303.

[10]Blasco C,C Van Poucke,C Van Peteghem.Analysis of meat samples for anabolic steroids residues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]J Chromatogr A, 2007,1154：230.

[11]Malekinejad H,P Scherpenisse,A A Bergwerf.Naturally occurring estrogens in processed milk and in raw milk(from gestated cows)[J].J Agric Food Chem,2006,54：9785.

[12]FuhM,S Huang,TLin.Determination of residual anabolic steroidsin meatby gas chromatography ion- trap mass spectrometer[J].Talanta,2004,64：408-411.

[13]StolkerA A M,PW Zoontjes,L A van Ginkel.The use of SFE for the Determination of Steroids in Animal Tissues[J].The Analyst,1998,123：2671-2676.

[14]Hooijerink H,vanBennekom EO,NielenM W F.Screening for gestagens in kidney fat using accelerated solvent extraction and liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry [J].Anal Chim Acta,2003,483(1-2)：51-59.

[15]Har tmann S,H Steinhart.S imultaneous determination of anabolic and catabolic steroid hor mones in meatby gas chromatography-mass spectrometry[J].Arch Lebensmittelhyg, 1997,48：111.

[16]Hartmann S,M Lacorn,H Steinhart.Natural occurrence of steroid hormones in food[J].Food Chem,1998,62：7-20.

[17]Kureckova K,B Maralikova,K Venture.Supercritical fluid extraction of steroids from biological samples and first experience with solid-phase microextraction-liquid chromatography[J].J ChromatogrB,2002,770：83.

[18]Din N,KD Bartle,A A Clifford,et al.Supercritical Fluid Extraction of Sulphamethazine and its Metabolites from meat tissues[J].J High Resol Chromatogr,1994,19：465.

[19]Huopalahti R P,J D Henion.The use of supercritical fluid extraction for the determination of steroids in cattle tissues[J].J Liquid Chromatogr Relat Technol,1996,19：69.

[20]Ridgway K,S P D Lalljie,R M Smith.Sample preparation techniques for the determination of trace residues and contaminants in foods[J].J ChromatogrA,2007,1153(1)：36.

[21]Liu R,J L Zhou,A W ilding.Microwave-assisted extraction followed by gas chromatography-mass spectrometry for the determination of endocrine disrupting chemicals in river sediments [J].J ChromatogrA,2004,1038：19.

[22]Hermo M P,D Barrón,J Barbosa.Determination of residues of quinolones in pig muscle Comparative study of classical and microwave extraction techniques[J].Anal Chim Acta,2005,539：77.

[23]陳捷,秦燕,張美金 .氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)動(dòng)物肌肉組織中殘留的甾類同化激素[J].色譜,2006,24(1)：19-22.

[24]Maume D,B Le Bizec,PMarchand,et al.N-methyl-N-alkylsilyltrifluoroacetamide-I2 as a new derivatization reagent for anabolic steroid control[J].Analyst,1998,123(12)：2645.

[25]BarontiC,R Curini,GD’Ascenzo,et al.Monitoring natural and synthetic estrogens at activated sludge sewage treatment plants and in a receiving riverwater[J].Environ Sci Tech,2000, 34：5059-5065.

[26]Van Poucke C,M Van De Velde,C Van Peteghem. Combination of liquid chromatography-tandem mass spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry for the detection of 21 anabolic steroid residues in bovine urine[J].J Mass Spectrom, 2005,40(6)：731.

[27]StolkerA A M,PW Zoontjes,P L W J Schwillens,et al. Determination of acetyl gestagenic steroids in kidney fat by automated supercritical fluid extraction and liquid chromatography ion-trap mass spectrometry[J].Analyst,2002,127：748-754.

Review of residualmulti-component analyticalmethods for the determination of steroid hormones in foods

YUM iao1,W U Shu-chun2
(1.Zhejiang Provincial Centre of Supervision and Testing ofQuality ofAgricultural Products,Hangzhou 310020,China; 2.ZhejiangMedical College,Hangzhou 310053,China)

This p ap e r reviewed recently p ub lished m ulti-res idue chrom a tog rap hic m e thods for the de te rm ina tion of s te roid horm ones in food.Afte r a b rief introduc tion on s te roid horm ones,an ove rview emp has ized on m ulti-res idue ana lytica lm e thods w ith de ta il exp lica tion,cove ring samp le extrac tion and p urifica tion as we ll as chrom a tog rap hic sep a ra tion and d iffe rent de tec tion m e thods,be ing in use for the de te rm ina tion of s te roid horm ones.Fina lly,the deve lopm ent trends of m ulti-res idue de tec tion m e thods for the de te rm ina tion of s te roid horm ones we re summ a rized.

s te roid horm ones;m ulti-res idue;ana lytica lm e thods

TS207.3

A

1002-0306(2010)02-0378-04

1 概述

性激素是一類由動(dòng)物體性腺所產(chǎn)生或人工合成的低分子量、親脂性、具有生物活性的類固醇類物質(zhì),根據(jù)其生物活性和藥理作用,可以將其分為重要的兩類：性類固醇和皮質(zhì)類固醇。前者又包括雌激素、孕激素和雄激素。另外目前還有很多人工合成的性激素,臨床應(yīng)用較多的如己烯雌酚。

從20世紀(jì)50年代起,性激素這一大類物質(zhì)就被用于動(dòng)物的喂養(yǎng),如今歐盟已經(jīng)對(duì)其在動(dòng)物喂養(yǎng)方面的使用進(jìn)行了嚴(yán)格禁止。同時(shí)關(guān)于性激素對(duì)人體的危害也引起了公眾的廣泛關(guān)注,有報(bào)道稱,近年來(lái)婦女子宮瘤、乳腺癌等病變發(fā)病率的逐漸升高與動(dòng)物源食品中的性激素殘留有關(guān)系[1]。各國(guó)政府相應(yīng)出臺(tái)了一系列的政策和標(biāo)準(zhǔn)來(lái)控制性激素的濫用,在此基礎(chǔ)各種關(guān)于性激素的檢測(cè)方法也逐步發(fā)展起來(lái)。如 GB/T5009.108畜禽肉中已烯雌酚的測(cè)定、SN/T1744-2006進(jìn)出口動(dòng)物飼料中己烷雌酚、已烯雌酚、雙烯雌酚殘留量的檢驗(yàn)方法 (氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法)、Sadao N[2]等采用 GC/MS(氣相色譜-質(zhì)譜)同時(shí)測(cè)定了水中的六種性激素、崔曉亮[3]等利用超高效色譜/串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定了牛奶中12種糖皮質(zhì)激素含量等。

2009-03-24

虞淼(1981-),男,碩士,助理農(nóng)藝師,研究方向：農(nóng)藥質(zhì)量分析、農(nóng)藥殘留分析、農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全。