李林強,昝林森,孟 嫚

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,陜西楊凌 712100; 2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

原子力顯微鏡在牛肉嫩度測定中的應(yīng)用研究

李林強1,2,昝林森1,＊,孟 嫚2

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院,陜西楊凌 712100; 2.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

【目的】探討原子力顯微鏡在牛肉嫩度測定中的應(yīng)用,為肉品嫩度提供可靠、直觀的測定方法。【方法】用 100、150、200mmol/L不同濃度氯化鈣(CaCl2)處理牛肉,肉樣真空包裝后于 4℃下成熟 72h后測定剪切力、肌原纖維指數(shù)(MFI),并用原子力顯微鏡觀察肌原纖維小片,比較三者結(jié)果?！窘Y(jié)果】三種測定方法結(jié)果基本一致,但有一定差異,原子力顯微鏡觀察肌原纖維小片直觀地反映了肌原纖維小片化程度。【結(jié)論】原子力顯微鏡能直觀地反映肉的嫩化情況,是對剪切力和MFI測定方法在形態(tài)學(xué)上的完善。

原子力顯微鏡,牛肉嫩度,剪切力,肌原纖維小片化指數(shù)

Binning等 1981年利用量子力學(xué)隧道效應(yīng)研制出掃描隧道顯微鏡 (scanning tunnel microscope, ST M),隨后Binnig與斯坦福大學(xué)的 Quate和 I BM蘇黎士實驗室的 Gerber1985年在 ST M基礎(chǔ)上改進推出了原子力顯微鏡 (atomic force microscope,AF M)[1],兩者均具有納米級超高分辨率。但相對于 ST M和普通電鏡,AF M通過其粗細只有一個原子大小的探針在非常近的距離上探索物體表面的情況,便可以分辨出其他顯微鏡無法分辨的極小尺度上的表面細節(jié)與特征[2]。肉質(zhì)嫩度是禽肉食用品質(zhì)的一個重要感官特征,也是肉品質(zhì)量的重要指標[3-4]。嫩度的客觀指標是剪切力值,肌原纖維小片化指數(shù) (myofibril fragmentation index,MFI)也是衡量肉嫩度的重要指標之一。由于剪切力在測定過程中很難保持肉塊厚度或肉柱直徑大小一致,可能導(dǎo)致測定誤差較大。19世紀 60年代研究發(fā)現(xiàn)肌肉的嫩度與肌原纖維的斷裂有關(guān)[5],提出了利用肌原纖維小片化指數(shù)(myofibril fragmentation index,MFI)來考察肉質(zhì)的嫩度[6],在 70年代才正式建立,相比其它嫩度測定技術(shù)而言,該方法建立的時間相對較晚,在有些方面還有待進一步研究和完善[7]。原子力顯微鏡是一種更為突出的顯微觀察技術(shù),本文通過用不同濃度 CaCl2(100、150、200mmol/L)處理牛肉,測定剪切力和MFI,并用原子力顯微鏡觀察肌原纖維小片,比較三者結(jié)果,擬探討原子力顯微鏡在測定牛肉嫩度中的應(yīng)用,以期為肉品嫩度的測定提供更為準確、可靠、直觀的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

CaCl2、KCl、K3PO4、EDTA、HCl、牛血清白蛋白Roche公司;CuSO4·5H2O,NaKC4H4O6·4H2O, NaOH,KI。

C-LM型肌肉嫩度計 東北農(nóng)業(yè)大學(xué);紫外分光光度計 UV-754,上海;勻漿器 德國;冷凍離心機SCR20BC,日立;原子力顯微鏡 Atomic Force Microscopy,WET-SP M-9500J3,日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肉樣采集與處理 2歲秦川公牛按照標準的屠宰工藝屠宰,胴體經(jīng)預(yù)冷 20h后,將左右兩側(cè)背最長肌取下(第 10胸椎到第 4腰椎),在每條背最長肌上從前往后依次分割 10塊厚 2.5cm肉塊,然后隨機分成 4組,每組 5塊,一組注射肉重 10%的蒸餾水。另外 3組分別注射肉重 10%的 100、150、200mmol/L CaCl2。將注射好的肉樣真空包裝后于 4℃下成熟 3d后測定各項指標。

1.2.2 剪切力測定 將修整后 2.5cm厚的分割肉塊真空包裝于 85℃水浴加熱至中心溫度 80℃,取出冷卻至室溫并放入 4℃冷藏間過夜,然后用直徑 1.27cm的中空取樣器沿肌纖維方向取樣。每塊肉鉆取 5個肉柱,然后用肌肉嫩度計垂直肌纖維方向測定每個肉柱的剪切力值。同一肉塊所有的剪切力值的平均值即為該肉塊的剪切力值。

1.2.3 肌纖維提取和MFI測定 去除肉樣可視脂肪和結(jié)締組織,稱取約 5g,放入勻漿器,加入 10mL 2℃分離介質(zhì) (100mmol/L KCl、20mmol/L K3PO4、0.1mmol/L EDT A、1mmol/L CaCl2、溶液用 HCl調(diào)整pH為 7.0),高速低溫勻漿 1min。勻漿在 4℃低溫離心機 3000×g下離心 15min,然后緩慢倒出上層清液,沉淀中又加入 10mL、2℃分離介質(zhì),用攪捧制成懸液,重復(fù)上述離心步驟,倒出上層清液,加入 2.5mL分離介質(zhì)于漩渦混合器上混勻,通過 200目篩網(wǎng)濾去結(jié)締組織,再加 2.5mL分離介質(zhì)來幫助肌原纖維通過篩孔,混勻肌原纖維懸浮液。利用標準牛血清白蛋白配制成不同濃度的蛋白,分別為 0、2、4、6、8、10mg/L,利用雙縮脲法其 540nm處的吸光值,以吸光值為縱坐標,蛋白濃度為橫坐標繪制標準曲線。用MFI分離介質(zhì)調(diào)整懸浮液蛋白濃度為 0.5±0.05mg/mL,在 540nm測吸光度,將所得結(jié)果乘 200后便得到MFI值。

1.2.4 原子力顯微鏡對肌原纖維小片的測定 按照上述方法制備混勻肌原纖維懸浮液(蛋白濃度為 0.5 ±0.05mg/mL),調(diào)整懸液體積為 10mL,混勻,吸取1μL肌原纖維懸液滴于云母片上,自然風干,直接進行原子力顯微鏡觀察。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 運用 SPSS軟件進行數(shù)據(jù)處理,結(jié)果以±sD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度 Ca2+對牛肉剪切力的影響

由圖 1可知,隨著 Ca2+濃度的增加,肉樣剪切力呈下降趨勢,表明肉的嫩度增加。不同濃度 Ca2+對牛肉處理后其剪切力均極顯著下降 (Plt;0.01), 100mmol/L和 150mmol/L,150mmol/L和 200mmol/L Ca2+處理牛肉間剪切力下降差異均不顯著 (Pgt; 0.05)。表明 150mmol/L Ca2+對牛肉處理嫩化效果較為理想。

圖 1 不同濃度 Ca2+對牛肉剪切力的影響

2.2 不同濃度 Ca2+對牛肉MF I的影響

由圖 2可知,隨著 Ca2+濃度的增加,肉樣MFI呈上升趨勢,但 200mmol/L Ca2+處理肉樣的MFI下降,與圖 1嫩化結(jié)果不同。100、150mmol/L Ca2+處理肉樣的MFI增加顯著 (Plt;0.05),200mmol/L Ca2+處理肉樣的MFI相對 100、150mmol/L Ca2+處理肉樣的MFI下降顯著 (Plt;0.05),這與上文剪切力測定結(jié)果不同。表明 150mmol/L Ca2+對牛肉處理嫩化效果較為理想,與上文分析結(jié)果基本一致,但處理間結(jié)果比較的差異不同。

圖 2 不同濃度 Ca2+對牛肉MFI的影響

2.3 原子力顯微鏡對肌原纖維小片測定

由圖 3可知,對照肉樣肌原纖維呈網(wǎng)狀連接,分離小片極少;隨著 Ca2+濃度的增加,處理肉樣肌原纖維小片依次顯著增多。肌原纖維小片越多,表明肌原纖維降解越多,肉的嫩度越大,可知,100、150、200mmol/L Ca2+處理肉樣嫩度依次增大,這與剪切力測定結(jié)果相似,但與以MFI作為嫩化指標有一定差異。又由圖 3可知,100mmol/L Ca2+處理肉樣肌原纖維直徑較大約為 2.5μm,150mmol/L Ca2+和200mmol/L Ca2+處理肉樣肌原纖維直徑約為 1μm,由于肌原纖維直徑是影響肉嫩度的主要因素之一[8-10],因此, 150mmol/L Ca2+和 200mmol/L Ca2+處理肉樣的嫩度要遠遠高于 100mmol/L Ca2+處理肉樣和對照嫩度,這與上文剪切力和MFI測定結(jié)果有一定的差異。

3 討論

本實驗所采用的 3個濃度水平的 Ca2+處理,以剪切力、MFI作為嫩化指標,結(jié)果表明,牛肉嫩度改善顯著(Plt;0.05),與原子力顯微鏡觀察測定肌原纖維小片結(jié)果基本一致。但剪切力測定結(jié)果表明,150、 2 0 0 m m o l／LC a2+對牛肉處理間結(jié)果差異不顯著(Pgt; 0.05),MFI測定結(jié)果表明,150mmol/LCa2+比100mmol/L Ca2+處理牛肉嫩度顯著 (Plt;0.05),這與原子力顯微鏡測定測定肌原纖維小片結(jié)果有所不同。原子力顯微鏡測定結(jié)果表明,200、150、100mmol/L Ca2+處理肉樣嫩度依次增大,而且處理間結(jié)果差異顯著。剪切力一般通過剪切力儀或質(zhì)構(gòu)儀剪切測定獲得,是用中空取樣器沿肌纖維方向取樣,然后用剪切力儀或質(zhì)構(gòu)儀垂直肌纖維方向測定肉柱的剪切力值。由于肉樣易變形,即使是同一肉柱直徑大小也不一,導(dǎo)致測定誤差較大,影響處理間差異的比較。MFI測定是通過制備肌原纖維懸浮液,通過肌原纖維懸浮液的吸光值來表示嫩度,是一種間接測定肉嫩度的方法,由于肌原纖維小片的大小對吸光值的影響較大,另外,在制備肌原纖維懸浮液的過程中勻漿速度、勻漿時間均影響肌原纖維斷裂指數(shù)測定[11-12]。因此,剪切力和 MFI測定值并不能完全反映肉的嫩化情況。而原子力顯微鏡通過測定肌原纖維小片化指數(shù)及肌原纖維直徑較能準確、直觀地反映肉的嫩化情況,是對MFI測定方法的改進和完善,同時又克服了剪切力測定不能直接觀察的缺點,因此,原子力顯微鏡是研究肉質(zhì)嫩度的有力工具,但其標準化操作還應(yīng)進一步研究。

圖 3 不同濃度 Ca2+對肌原纖維小片化的影響

4 結(jié)論

原子力顯微鏡能直觀地反映肉的嫩化情況,是對剪切力和MFI測定方法在形態(tài)學(xué)上的完善,是研究牛肉嫩度有力的輔助工具。

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Study on application of atomic force microscopy in beef tendernessmeasurement

L IL in-qiang1,2,ZAN L in-sen1,＊,M ENGMan2
(1.College ofAnimal Science and Technology,Northwest Sci-Tech University ofAgriculture and Forestry,Yangling 712100,China;2.College of Food Engineering and Nutritional Science,ShaanxiNor malUniversity,Xi’an 710062,China)

【O b jec tive】App lica tion of a tom ic force m ic roscop y in beef tende rness m easurem ent was s tud ied to supp ly re liab le and intuitive m e thod for m ea t tende rness m easurem ent.【M e thod】Beef was tende riza tion trea ted w ith100,150and200mm ol/L ca lc ium chloride(CaC l2);itwas vacuum-p acked s tored a t4℃for three days,shea r force and m yofib ril fragm enta tion index(M FI)was m easured,and m yofib ril fragm enta tion was obse rved w ith a tom ic force m ic roscop y(AFM)wha teve r results we re comp a red w ith.【Result】The results of the three kindsof de te rm ina tion m e thod we re the sam e bas ica lly.But the re was a little d iffe rent.M yofib ril fragm enta tion deg ree was intuitive ly reflec ted by AFM obse rva tion.【Conc lus ion】AFM can intuitive ly reflec t the beef tende rness change in tende riza tion.It can p e rfec t shea r force and M FIm easurem entm e thod on m orp hology.

a tom ic force m ic roscop e;beef tende rness;shea r force;m yofib ril fragm enta tion index

TS251.7

A

1002-0306(2010)02-0111-03

2009-03-19 ＊通訊聯(lián)系人

李林強(1971-),男,博士研究生,研究方向:畜產(chǎn)品及功能食品研究。

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)專項 (nyhyzx07-035);國家科技支撐計劃-農(nóng)林動物育種專項 (2006BAD01A10-3);陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程(2007ZDCY-01)。