高華杰,李雨菲,剛永運(yùn),何洪巨

(1.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100048;2.北京師范大學(xué)附屬實(shí)驗(yàn)中學(xué),北京 100032; 3.國(guó)家蔬菜工程技術(shù)研究中心,北京 100097)

紫皮豇豆(VIGNA UNGUICULATA L.)花色苷的研究

高華杰1,李雨菲2,剛永運(yùn)2,何洪巨3,＊

(1.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,北京 100048;2.北京師范大學(xué)附屬實(shí)驗(yàn)中學(xué),北京 100032; 3.國(guó)家蔬菜工程技術(shù)研究中心,北京 100097)

首次應(yīng)用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-DAD-MS)鑒定出紫皮豇豆主要含有三種花色苷,分別為飛燕草色素、矢車(chē)菊色素、天竺葵色素的葡萄糖苷,其中矢車(chē)菊葡萄糖苷相對(duì)百分含量達(dá)到 93.4%;應(yīng)用 pH示差法測(cè)定出其單體花色苷的含量為 57.15mg/100g鮮重;應(yīng)用DPPH法測(cè)定結(jié)果顯示,花色苷粗提液有較強(qiáng)的抗氧化能力。

紫皮豇豆,花色苷,抗氧化性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫皮架豇豆(J1、J58、J229) 于 2008年 7月 31號(hào)采自北京市延慶農(nóng)場(chǎng);鹽酸、甲醇、乙醇、磷酸氫二鈉、氯化鉀、乙酸乙酯、三氟乙酸 (TFA) 均為分析純;乙腈 色譜純。

離心機(jī) 飛鴿牌,TDL-40B;HJ-3恒溫磁力攪拌器 江蘇金壇醫(yī)療儀器廠;電子天平 Sartorius BS210S;紫外分光光度儀 H ITACH I U-3410;高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 島津公司：DGU-20A5脫氣機(jī) Degasser;LC-20AD高壓泵 Pump;S IL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器 Auto SamLpler;CBM-20A色譜工作站Communications BusModule;SPD-20A紫外 /可見(jiàn)光檢測(cè)器 UV/V IS Detector;CT O-20A柱溫箱Column Oven;組織搗碎機(jī),真空泵,布氏漏斗, millipore制水機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫皮豇豆花色苷粗提液的制備 將收獲的紫皮豇豆洗凈晾干,切碎,準(zhǔn)確稱(chēng)取 30g置于組織搗碎機(jī)里磨碎,加入酸化甲醇 (v/v=1%),置于 4℃冰箱中1h,用布氏漏斗抽濾,濾液轉(zhuǎn)移到500mL的容量瓶中,濾渣則加入酸化甲醇 (v/v=1%),置于冰箱中再靜置 1h,再次抽濾。重復(fù)提取,直到濾液為無(wú)色時(shí)止,將濾液合并,定容至 500mL,置于 4℃冰箱中保存,待后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2.2 紫皮豇豆單體花色苷含量的測(cè)定 準(zhǔn)確量取等體積的花色苷粗提液兩份,分別旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去掉溶劑,一份用pH1.0的緩沖液溶解,一份用 pH4.5的緩沖液溶解,靜置 2h后測(cè)定,測(cè)定原理及方法參照文獻(xiàn)[8]。

1.2.3 紫皮豇豆花色苷種類(lèi)的鑒定 紫皮豇豆花色苷溶液的純化方法與文獻(xiàn)[9]相同。

花色苷分離鑒定所用的儀器是島津公司生產(chǎn)LCMS-IT-TOF,色譜分離所用的色譜柱為：150× 4.6mm i.d.,5UMSS Wakosil C18,柱溫為 32℃,流動(dòng)相由A液(0.1%TFA-水溶液)和B液(0.1%TFA-乙腈溶液)組成。洗脫梯度為 0.01min 10%B,0.01～2min 10%B,2～30min 20%B,30～40min 30%B;流速為1.2mL/min。二極管陣列檢測(cè)器的掃描波長(zhǎng)范圍是250～600nm。

質(zhì)譜參數(shù)：霧化氣流速 1.5L/min,曲形脫溶劑管溫度為 200℃,檢測(cè)電壓為 1.75kV,掃描對(duì)象為質(zhì)荷比為 200～1500的正離子。

1.3 花色苷的抗氧化能力測(cè)定

測(cè)定原理與方法參考文獻(xiàn) [10],略有改動(dòng)。如表 1所示加樣,用力搖勻,靜置 30min后,加入 1cm比色皿中進(jìn)行吸光度的測(cè)定,測(cè)出 A0、Ai、Aj的吸光度值,按下列公式 1進(jìn)行清除率的計(jì)算,運(yùn)用 Origin8軟件作圖并找出半抑制率濃度 (I C50)。

式中：A0-未加提取液的 DPPH·溶液的吸光度,以甲醇作空白;Ai-加入提取液后的DPPH·溶液的吸光度,以甲醇作空白;Aj-提取液與提取劑混合后的吸光度,以甲醇作空白。

表1 清除DPPH·實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1 紫皮豇豆中花色苷的含量

pH示差法被用于測(cè)定花色苷的含量,是基于花色苷溶液的顏色隨著 pH的變化發(fā)生可逆性的改變,在 pH為 1時(shí)主要以有顏色的形式存在,在 pH為 4.5時(shí)主要以無(wú)色形式存在,這兩種 pH的色素溶液在520nm下的吸光度的差別,與色素的濃度成比例[8]。矢車(chē)菊葡萄糖苷是植物中存在最廣的單體花色苷[7],所以以它作為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)表達(dá)單體花色苷的總量。而多聚花青素降解后形成的單體花青素,其顏色不會(huì)隨著 pH的變化而變化,它們?cè)?pH為 1和 pH為 4.5時(shí)的吸光率是相同的,這樣就消除了花色苷粗提液中常?；煊械亩嗑刍ㄇ嗨貙?duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

表 2 三種紫皮豇豆花色苷含量(mg/100g FW)

由表 2可知,紫皮豇豆 J58的含量高于另外兩種紫皮豇豆的含量,與文獻(xiàn)中報(bào)道[12]的一些水果蔬菜的花色苷含量 (黑豆花色苷含量為 44.5mg/100g,紫洋蔥為 48.5mg/100g)比較,J58中花色苷的含量也是比較高的,因此,紫皮豇豆尤其是 J58可作為花色苷的一個(gè)重要來(lái)源。

2.2 紫皮豇豆花色苷種類(lèi)鑒定

紫皮豇豆花色苷種類(lèi)由對(duì) HPLC-DAD-T OF MS生成的譜圖分析,結(jié)合出峰順序,參照相關(guān)文獻(xiàn)鑒定得出。由圖 1～圖 4可知,J58的主要物質(zhì)峰有三個(gè),其中二號(hào)峰為主峰,積分面積最大,此外還有兩個(gè)明顯的小峰,在一號(hào)峰與二號(hào)峰之間還有一些更小的峰,但由于其含量太低,超出儀器的最低檢測(cè)限,故不在本次檢測(cè)范圍內(nèi)。由表 3可知,二號(hào)峰的面積占總積分面積的 93.4%,一號(hào)峰占 5.1%,三號(hào)峰占1.5%;二號(hào)峰的純度達(dá)到 98%,其光譜圖顯示,可見(jiàn)光區(qū)最大吸收峰為515nm,該峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示分子離子質(zhì)荷比為 449,碎片離子質(zhì)荷比是 287,與文獻(xiàn)[13]對(duì)照可知,該峰代表的物質(zhì)可能是矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷 (cyanidin3-O-glucoside);一號(hào)峰分子離子質(zhì)荷比、碎片離子質(zhì)荷比分別是 465、303,可見(jiàn)光區(qū)最大吸收波長(zhǎng)是 523nm,與文獻(xiàn)[14]比較可知,該峰代表的物質(zhì)可能是飛燕草 3-葡萄糖苷 (delphinidin 3-O-glucoside);三號(hào)峰分子離子質(zhì)荷比、碎片離子質(zhì)荷比分別是 433、271,可見(jiàn)光區(qū)最大吸收波長(zhǎng)為500nm,低的最大吸收波長(zhǎng)及質(zhì)譜數(shù)據(jù)顯示該峰代表的物質(zhì)一定是天竺葵色素的糖苷化合物,即天竺葵3-葡萄糖苷 (pelargornidin 3-O-glucoside)[15]。

表 3 紫皮豇豆花色苷色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖1 紫皮豇豆花色苷色譜圖

圖2 紫皮豇豆二號(hào)峰的光譜圖

圖 3 紫皮豇豆花色苷二號(hào)峰的一級(jí)質(zhì)譜圖

圖 4 紫皮豇豆花色苷二號(hào)峰的二級(jí)質(zhì)譜圖

2.3 花色苷粗提液抗氧化性研究

本實(shí)驗(yàn)用DPPH法來(lái)評(píng)價(jià)紫皮豇豆花色苷的抗氧化能力,以VC、BHT作為參照。I C50是抗氧化劑對(duì)DPPH的清除率達(dá)到 50%時(shí)抗氧化劑的濃度,濃度越低說(shuō)明該抗氧化劑的抗氧化能力越強(qiáng)。由表 4可知,3.6177mg/mL紫皮架豇豆就清除自由基能力理論上來(lái)說(shuō)相當(dāng)與 0.0157mg/mL VC,可見(jiàn)紫皮架豇豆是值得推薦的有較強(qiáng)抗氧化能力的蔬菜。

圖5 不同濃度的花色苷溶液對(duì)DPPH·的清除率

表4 不同材料對(duì)DPPH·的半抑制率濃度

3 結(jié)論

結(jié)果表明,紫皮豇豆莢果花色苷含量較高,所含花色苷以矢車(chē)菊 3-葡萄糖苷為主,除了三種含量高的花色苷得到鑒定外,還有幾個(gè)峰由于含量低沒(méi)有得到鑒定,有待進(jìn)一步研究;花色苷粗提液中有許多雜質(zhì)對(duì)花色苷起到輔色作用,這些雜質(zhì)有待鑒定,從而有助于研究花色苷同別的物質(zhì)之間的關(guān)系,這對(duì)提高花色苷穩(wěn)定性的研究及應(yīng)用有巨大價(jià)值;本文只用DPPH法測(cè)定了花色苷的抗氧化性,由于方法的選擇也會(huì)對(duì)結(jié)果造成一定的影響,應(yīng)該嘗試多用幾種方法來(lái)測(cè)定,通過(guò)不同方法間的比較以減少方法造成的誤差,這一點(diǎn)也是值得進(jìn)一步研究的地方。

從天然植物中尋找有效的抗氧化成分應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、食品、保健品之中是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一,而花色苷不僅可作為抗氧化劑,更是優(yōu)良的食品著色劑,這使得近年來(lái)花色苷的研究越來(lái)越受到重視。紫皮豇豆纖維素含量少,花色苷含量比較高,所以既是優(yōu)良的保健蔬菜又可作為花色苷的來(lái)源,研究和應(yīng)用前景廣闊。

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Study on anthocyanins in purple cowpea(Vigna unguiculata L.)

GAO Hua-jie1,L IYu-fei2,GANG Yong-yun2,HE Hong-ju3,＊
(1.College ofLife Sciences,CapitalNor malUniversity,Beijing 100048,China; 2.The Exper imental High SchoolAttach to BeijingNor malUniversity,Beijing 100032,China; 3.National Engineering Research Center forVegetables,Beijing 100097,China)

Purp le cowp eas(Vigna unguicula ta L.)we re extrac ted w ith of0.1%HC l in m e thanol solution,p urified on a C-18solid ca rtridge,quantified by the pH d iffe rentia l m e thod,and cha rac te rized by m eans of HPLC-DAD-IT/ TO FMS ana lys is for the firs t t im e.Antioxidant ac tivity of extrac ts was sc reened us ing DPPH rad ica l scaveng ing m e thods.The content of anthocyanins in the p urp le cowp eas was57.15m g/100g FW.Three kinds of anthocyanin riched in the extrac ts which exhib ited s trong antioxidant ac tivity we re identified,they we re de lp hinid in3-O-g lucos ide,cyanid in3-O-g lucos ide,p e la rgornid in3-O-g lucos ide.

p urp le cowp ea;anthocyanins;antioxidant ac tivity

TS255.1

A

1002-0306(2010)03-0155-04

隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng),天然產(chǎn)物正逐漸取代化工合成產(chǎn)物在人們生活中所占的地位,在這種社會(huì)趨勢(shì)中,天然來(lái)源的食品著色劑越來(lái)越受到人們的關(guān)注[1]。在眾多的天然色素中,花色苷 (Anthocyanin)因其獨(dú)特的性質(zhì)成為了廣為研究的對(duì)象,因?yàn)榛ㄉ盏念伾秶軐?從紅到藍(lán),包括桔黃色、紫色等顏色[2];它在植物體中的分布也廣,不僅存在于植物的花朵、果實(shí)中,在一些植物中,莖、葉、根以及一些貯藏器官也含有大量花色苷[3];更為重要的是花色苷有超強(qiáng)的抗氧化能力,對(duì)人類(lèi)許多慢性和衰老方面的疾病如心臟病、癌癥、帕金森癥以及對(duì)衰老有很好的預(yù)防和 (或)治療作用[4]?；ㄉ帐侵参飦?lái)源的水溶性色素-花色素 (Anthocyanidin)的糖苷化合物,屬于類(lèi)黃酮類(lèi)多酚化合物,到目前為止已經(jīng)在 25科 73屬植物中發(fā)現(xiàn)了 575種[5]。這些單體花色苷之間的區(qū)別在于與母核結(jié)構(gòu)相連的羥基、甲氧基、糖基的位置、數(shù)目、性質(zhì)以及與糖基連接的脂肪酸和 (或)芳香酸的數(shù)目、性質(zhì)不同[6]。在高等植物中,含量最高的花色苷是矢車(chē)菊 3-葡萄糖苷[7],而花色苷含量最高的是漿果類(lèi)植物,如葡萄皮、藍(lán)莓等。篩選價(jià)格低廉、花色苷含量高的植物品種既是花色苷研究中的基礎(chǔ)也是重要的工作。對(duì)于大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)的人民來(lái)說(shuō),蔬菜在日常飲食中要比水果、保健品占得比重高,所以篩選、培育一些富含花色苷的蔬菜,讓人們普遍享受到花色苷對(duì)人體健康的益處,其意義是重大的。紫皮豇豆 (V igna unguiculataL.)蔓生,豆科一年生草本植物,是豇豆的一個(gè)地方品種,因夾的顏色為紫色而得名。紫皮豇豆含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、膳食纖維,還含有多種人體必需的維生素及微量元素。我國(guó)醫(yī)學(xué)很早就有紫豇豆種子入藥,能健胃補(bǔ)氣、滋養(yǎng)消食的記載。但是,迄今為止還沒(méi)有對(duì)紫皮豇豆中的花色苷進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)研究。本文就紫皮豇豆花色苷的含量,種類(lèi)及其粗提取液的穩(wěn)定性和抗氧化性進(jìn)行初步研究,旨在為紫皮豇豆及其花色苷的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

2009-03-30 ＊通訊聯(lián)系人

高華杰(1982-),男,碩士,研究方向：藥用植物學(xué)。