陳尚珂,孫建富,王愛英,沈海濤,祝建波

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003)

天山雪蓮△9硬脂酰脫飽和酶基因信號肽的功能分析＊

陳尚珂,孫建富,王愛英,沈海濤,祝建波

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832003)

為了驗(yàn)證天山雪蓮△9硬脂酰脫飽和酶基因sikSA D信號肽的功能,本研究利用PCR法從已構(gòu)建的天山雪蓮cDNA文庫中克隆了sikSA D的96 bp信號肽序列,將其與報告基因GFP連接,成功構(gòu)建了融合基因植物表達(dá)載體pCMBIA2301-sp-GFP。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草NC89,獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過激光共聚焦顯微鏡觀察GFP在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的激發(fā)熒光,確定天山雪蓮△9硬脂酰脫飽和酶sikSA D定位于天山雪蓮的葉綠體中。關(guān)鍵詞:sikSA D;導(dǎo)肽;GFP;亞細(xì)胞定位

Abstract:To authenticate the function ofsikSA D's signal peptide,the 96 bp signal peptide sequence by using PCR from cDNA library ofS asussured involucrateKar.et Kir which had been constructed was cloned,then ligated with report geneGFP,constructed a plant expression vector pCMBIA2301-sp-GFP.Transformed them into tobacco NC89 byA grobacterium-mediated transformation method,and got the transgenic plant.Subcellular localization ofsikSA Dwas examined by laser confocal microscope by using the approaches of GFP-tagging.

Key words:sikSA D;targeting peptide;GFP;subcellular localization

利用不同來源的信號肽改造蛋白質(zhì)序列,制備各種融合蛋白,由此改變蛋白質(zhì)的定位,以提高外源蛋白的表達(dá)量,在基因工程應(yīng)用領(lǐng)域顯示了廣闊的前景[1]。擬南芥FAD5(SAD3)不同于其它的SAD酶(stearoyl-ACP desaturase),在其 N端包含著71aa轉(zhuǎn)位到葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。將該基因定位到細(xì)胞質(zhì)表達(dá),酶區(qū)域?qū)Ｒ恍源呋?→Δ9增加了 70倍[2]。擬南芥脫飽酶(SAD)家族成員可以在不改變基因編碼區(qū)序列的情況下,通過不同細(xì)胞定位改變酶催化的特異性[3]。馬建忠等[4]從波菜葉中克隆了1個SAD同功能基因,其也存在2個大小不同的基因編碼框,比Nishida等的波菜 SAD的多11aa,轉(zhuǎn)基因煙草同樣明顯提高了抗寒性。

本實(shí)驗(yàn)室從天山雪蓮(S asussured involucrata Kar.et Kir)中克隆了Δ9硬脂酰-ACP脫飽和酶基因,為了有效分析sikSA D基因在細(xì)胞中的準(zhǔn)確定位,本研究構(gòu)建其植物表達(dá)載體pCMBIA2301-sp-GFP,轉(zhuǎn)化煙草NC89,得到轉(zhuǎn)基因植株,并用激光共聚焦顯微鏡觀察報告基因 GFP在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá),以證明sikSA D在植物中定位于葉綠體,以期為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能提供了線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株,質(zhì)粒載體及植株

E.coliDH 5α菌株,GV3101菌株,p GM-T質(zhì)粒,pCMBIA 2301質(zhì)粒,p7A-GFP質(zhì)粒以及煙草NC89均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 工具酶和相關(guān)試劑

Taq DNA聚合酶,限制性內(nèi)切酶Xho I、Nco I、Hind III、EcoR I以及 T4DNA連接酶均為 Fermantas公司產(chǎn)品,DNA片段回收試劑盒為Promaga公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計及合成

按照引物設(shè)計原則,根據(jù)sikSA D信號肽cDNA序列設(shè)計1對引物,為了構(gòu)建植物表達(dá)載體,分別加上 X hoI、NcoI酶切位點(diǎn)。引物序列如下:

1.2.2 載體構(gòu)建及鑒定

利用上述引物以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從天山雪蓮cDNA文庫中獲得195 bp大小的前導(dǎo)肽片段。PCR反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性4 min,(94℃30 s,52℃45 s,72℃30 s)30個循環(huán),72℃終延伸7 min。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果?；厥漳康钠芜B接至p GM-T載體,轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆,PCR鑒定后再以Xho I/Nco I雙酶切。測序正確后,回收酶切目的片段。同時用相同雙酶切pA7-GFP質(zhì)粒,回收目的大小的片段進(jìn)行連接,構(gòu)建pA7-sp-GFP載體。得到陽性克隆后,用PCR及雙酶切方法進(jìn)行鑒定,篩選正確的陽性克隆。然后用 Hind III/EcoR I雙酶切,同時切pCMBIA 2301載體,回收目的大小的基因及載體片段后進(jìn)行連接,即植物表達(dá)載體pCMBIA 2301-sp-GFP,用PCR和酶切的方法篩選正確的陽性克隆。用相同的方法構(gòu)建對照載體pCMBIA 2301-GFP并鑒定。

1.2.3 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草及再生

將已構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌GV3101。取NC89煙草無菌葉片,切成1 cm2左右的小塊,放置于用MS液體培養(yǎng)基稀釋的農(nóng)桿菌菌液中浸泡15 min,然后用無菌濾紙吸去多余菌液,于MS固體培養(yǎng)基(不含抗生素)中25℃暗培養(yǎng)2 d;把葉片轉(zhuǎn)入含100 mg/L Kan和50 mg/L Cb分化培養(yǎng)基中,25℃光下培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織生芽;將長至1 cm左右的芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根,即獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。

1.2.4 用GFP標(biāo)簽檢測 sikSAD的亞細(xì)胞定位

取非轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)基因煙草的葉片,撕取葉表皮,制成水封片,采用型號為LSM 510 META激光共聚焦顯微鏡,在多線氬離子激光束(25 mW)照射條件下,檢測488 nm激發(fā)熒光(FITC),觀察非轉(zhuǎn)基因煙草葉片和轉(zhuǎn)基因煙草葉片綠色熒光的表達(dá),以確定sikSA D的亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果

2.1 信號肽亞細(xì)胞定位的生物信息學(xué)分析

2.1.1 信號肽的序列及疏水性分析

本實(shí)驗(yàn)室從天山雪蓮(Sasussured involucrata Kar.et Kir)中克隆了Δ9硬脂酰-ACP脫飽和酶基因,命名為 sikSAD,并登錄 Genbank,登錄號為 No.DQ516384。sikSAD基因全長為1191 bp,編碼396個氨基酸,與菊科植物紅花(C.tinctorius),向日葵(Helianthus annuus)進(jìn)化度最高,同源性達(dá)96%。

以紅花蛋白序列N端有一段32個氨基酸前導(dǎo)肽序列(sbjct1)與雪蓮 SA D的前導(dǎo)序列進(jìn)行比對分析,結(jié)果(圖1)顯示,雪蓮 sikSA D基因 N端信號肽序列(Query1)中第6位和第23位氨基酸與紅花的不同。預(yù)計的前導(dǎo)序列的氨基末端M-L帶有2個精氨酸和賴氨酸正電荷殘基,隨后的Q-F有1個疏水的核心區(qū),最后的丙氨酸是信號肽酶水解的切割位點(diǎn)(圖2),完全符合信號肽的結(jié)構(gòu)特征。

圖1 sikSAD信號肽的序列分析Fig.1 Sequence analysis of sikSAD's signal peptide

圖2 sikSAD信號肽的疏水性分析Fig.2 Hydrophobicity analysis of sikSAD's signal peptide

2.1.2 信號肽亞細(xì)胞定位的在線分析

通過不同的導(dǎo)肽分析軟件分析了sikSAD基因N端32aa的信號肽序列,發(fā)現(xiàn)用不同的導(dǎo)肽在線軟件分析得到不同的結(jié)論。用 Targetp v1.1分析其傾向于定位在線粒體上(圖3),但用 Softberry-Prot-Comp 8.0分析時,又認(rèn)為其定位在葉綠體上(圖4)。

圖3 Targetp v1.1分析Fig.3 Analysis of targetp v1.1

targetp v1.1分析顯示其傾向于定位在植物細(xì)胞的線粒體上。Softberry-ProtComp 8.0分析顯示其定位在植物細(xì)胞的葉綠體上。

圖5 pGM-T-SP重組子PCR檢測瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 PCR detection of the recombinant pGM-T-SP-products

2.2 載體的構(gòu)建與鑒定

2.2.1 sikSAD基因前導(dǎo)肽片段的擴(kuò)增及克隆

將sikSA D基因前導(dǎo)肽的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pUCM-T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,提取質(zhì)粒,經(jīng)PCR和酶切鑒定,分別得到1條約195 bp和189 bp的條帶(圖5、6),測序結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致。這表明目的基因已構(gòu)建到p GM-T載體上,并成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌。

圖 6 Nco I、Xho I pGM-T-SP重組質(zhì)粒Fig.6 Restriction enzyme Nco I and Xho I digestion of the recombinant pGM-T-SP

2.2.2 p7A-sp-GFP的構(gòu)建

分別用 Xho I、Nco I對 p7A-GFP和 p GM-TS P進(jìn)行酶切,回收目的條帶,連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。提取重組子質(zhì)粒p7A-sp-GFP,經(jīng) PCR擴(kuò)增,瓊脂糖凝膠電泳,可見195 bp的亮帶。再用 Hind III、EcoRⅠ對重組子進(jìn)行酶切,即得到 35S-sp-GFP,與預(yù)期大小一致的片段(圖6、7)。

圖7 pA-sp-GFP重組子PCR檢測瓊脂糖凝膠電泳Fig.7 PCR detection of the recombinant pA7-sp-GFP products

圖8 HindⅢ、EcoR I酶切pA7-sp-GFP重組質(zhì)粒Fig.8 Restriction enzyme HindⅢand EcoR I digestion of the recombinant pA7-sp-GFP

2.2.3 pCMBIA 2301-sp-GFP的構(gòu)建

分別用 Hind III、EcoRⅠ對p7A-S P-GFP和載體pCMBIA 2301進(jìn)行酶切,回收目的條帶,連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。提取質(zhì)粒后,經(jīng) PCR和 Hind III、EcoRⅠ雙酶切,電泳,可見與預(yù)期大小一致的條帶(圖9)。將重組子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,菌液 PCR后,得到195 bp大小的條帶(圖10)。表明植物表達(dá)載體pCMBIA 2301-sp-GFP構(gòu)建完成,并成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌和農(nóng)桿菌。

圖9 Hind Ⅲ、EcoR I酶切pCMBIA 2301-sp-GFP重組質(zhì)粒Fig.9 Restriction enzyme HindⅢand EcoR I digestion of the recombinant pCMBIA 2301-sp-GFP

圖10 pCMBIA 2301-sp-GFP重組子PCR檢測瓊脂糖凝膠電泳Fig.10 PCR detection of the recombinant pCMBIA 2301-sp-GFP products

2.3 激光共聚焦檢測 GFP在煙草細(xì)胞中的定位

非轉(zhuǎn)基因煙草的氣孔及其他葉肉細(xì)胞在激發(fā)光下無熒光發(fā)生。轉(zhuǎn)GFP基因煙草的葉肉細(xì)胞中有大量熒光表達(dá),氣孔周圍保衛(wèi)細(xì)胞及表皮細(xì)胞基質(zhì)中有大量熒光激發(fā)(圖1),而轉(zhuǎn)pCMBIA2301-sp-GFP基因煙草葉表皮中只有有葉綠體存在的氣孔兩側(cè)保衛(wèi)細(xì)胞及腺毛細(xì)胞可見熒光激發(fā)。

圖11 不同背景下非轉(zhuǎn)基因煙草及轉(zhuǎn)pCMBIA 2301-sp-GFP、pCMBIA2301-GFP基因煙草葉表皮細(xì)胞Fig.11 Leaf epidermal cells of transgenic tobaccos and non-transgenic tobaccos

3 討論

本研究構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCMBIA 2301-sp-GFP及pCMBIA 2301-GFP并轉(zhuǎn)到煙草NC89中表達(dá),利用 GFP確定sikSA D在細(xì)胞中的亞定位。經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果表明,非 GFP轉(zhuǎn)基因煙草細(xì)胞在488 nm激發(fā)光下不發(fā)光,GFP轉(zhuǎn)基因煙草的葉肉細(xì)胞中可見大量綠色熒光表達(dá),由于葉肉細(xì)胞過分密集且細(xì)胞體積較小,不易觀察。所以撕取體積較大的葉表皮細(xì)胞進(jìn)一步詳細(xì)觀察。轉(zhuǎn)pCMBIA 2301-GFP基因的煙草在細(xì)胞基質(zhì)中廣泛存在著可見熒光。pCMBIA 2301-sp-GFP轉(zhuǎn)基因煙草葉表皮細(xì)胞中只有氣孔周圍和腺毛細(xì)胞中可激發(fā)明顯可見熒光。在植物表皮細(xì)胞中,只有保衛(wèi)細(xì)胞和腺毛細(xì)胞存在葉綠體。因此,我們認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)克隆的前導(dǎo)肽定位于葉綠體中。

利用信號肽來提高外源基因的表達(dá)量是目前基因工程操作的一個重要的策略。在抗蟲蛋白基因Cpti的5′和3′末端增加了信號肽編碼序列和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號 KDEL編碼序列,使轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲性均比未修飾的轉(zhuǎn)基因植物有顯著提高[5]。而修飾豌豆儲藏蛋白(液泡定位蛋白)基因,可使外源豌豆儲藏蛋白在苜蓿植株中積累量提高近百倍[6]。本實(shí)驗(yàn)室將擬南芥泛素基因與煙草病程相關(guān)蛋白 PR1a基因的信號肽序列體外重組,構(gòu)建帶有泛素和信號肽融合序列的高效植物表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)外源蛋白在植物體內(nèi)的有效積累[7]。

在高等植物中,葉肉細(xì)胞一般含50～200個葉綠體,可占細(xì)胞質(zhì)的40%,由于葉綠體在植物體中含量豐富,將蛋白定位于葉綠體中表達(dá)可以提高外源基因的表達(dá)量。將擬南芥rbc S亞基的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列連接于殺蟲蛋白基因之前,發(fā)現(xiàn)殺蟲蛋白能夠特異性地積累在轉(zhuǎn)基因煙草的葉綠體內(nèi),外源蛋白總的積累量比對照提高了10～20倍[8]。本實(shí)驗(yàn)sik-SA D基因的信號肽構(gòu)建的通用植物表達(dá)載體可以作為植物基因工程的新手段將外源蛋白引導(dǎo)到細(xì)胞葉綠體中定位表達(dá)。

[1]韋雪芳,王冬梅,劉思,等.信號肽及其在蛋白質(zhì)表達(dá)中的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報,2006(6):38-42.

[2]Heilmann I,Pidkowich M S,Girke T,et al.Switching desaturase enzyme specificity by alternate subcellular targeting[J].Proc Natl Acad Sci,USA,2004,101:10266-10271.

[3]Thompson G A,Scherer D E,Foxall Van Aken S.Primary structures of the precursor and mature forms of stearoyl-acyl carrier protein desaturase from safflower embryos and requirement of ferredoxin for enzyme activity[J].Proc Natl Acad Sci,USA,1991,88(6),2578-2582.

[4]馬建忠,劉丹,傅幼英.菠菜硬脂酞基載體蛋白去飽和酶(SAD)基因的分子克隆[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,1996,4(l):33-37.

[5]朱禎,林忠平.走向21世紀(jì)的植物分子生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2000.

[6]Wandelt C I,Khan M R,Craig S,et al.Vicilin with carboxy-terminal KDEL is retained in the endoplasmic reticulum and accumulates to high levels in the leaves of transgenic plants[J].Plant J,1992,2(2):181-192.

[7]史芳芳,周鵬,武冬梅,等.泛素和 PR1a信號肽融合基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J].石河子大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2006,24(3):265-269.

[8]Wang E Y,Hironaka C M,Fischhoff D A.A rabidopsis thalianasmall subunit leader and transit peptide enhance the expression ofBacillus thuringiensisproteins in transgenic plants[J].Plant Mol Biol,1992,20:81-93.

A Functional Analysis ofsikSAD’s Signal Peptide

CHEN Shangke,SUN Jianfu,WANG Aiying,SHEN Haitao,ZHU Jianbo
(Key Laboratory of Agricultural Biotechnology,College of Life Sciences,Shihezi University,Shihezi 832003,China)

Q785

A

1007-7383(2010)04-0441-05

2009-04-13

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2007AA021401),國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30960034)

陳尚珂(1982-),女,碩士生,專業(yè)方向?yàn)橹参锘蚬こ?e-mail:chloe.k@163.com。

祝建波(1967-),男,副研究員,從事植物基因工程等研究;e-mail:zjbshz@126.com。