蘇東民，胡麗花，蘇東海*，辛秀蘭，李自紅

(1.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南 鄭州 450052；2.北京電子科技職業(yè)學院，北京 100029)

饅頭發(fā)酵過程中酵母菌和乳酸菌的代謝作用

蘇東民1，胡麗花1，蘇東海2,*，辛秀蘭2，李自紅1

(1.河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南 鄭州 450052；2.北京電子科技職業(yè)學院，北京 100029)

和制饅頭面團時，添加20%由酵母菌(Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.0562)和/或乳酸菌(Lactobacillus brevis CGMCC 1.0579)發(fā)酵的老面團進行混合發(fā)酵，通過檢測pH值、總酸度及可溶性糖含量的變化，研究老面團饅頭發(fā)酵過程中微生物生長及代謝特性。采用高效液相色譜 (HPLC)-蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測可溶性糖(麥芽糖、蔗糖、果糖、葡萄糖)含量，其流動相為乙腈-水體積比70:30，流速1.0mL/min，柱溫25℃，ELSD漂移管溫度83.5℃，載氣空氣流速2.2L/min。結果顯示：與對照組相比，添加老面團的樣品pH值較低，TTA值較高，尤其是添加單一乳酸菌發(fā)酵老面團的樣品酸度最低；不同樣品發(fā)酵過程中各種可溶性糖的含量及變化趨勢存在差異。由此看出，不同菌種對原料的利用不同，所以饅頭面團發(fā)酵過程中代謝產酸及可溶性糖含量變化存在差異，這很可能會影響到饅頭的品質。

饅頭；酵母菌；乳酸菌；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)；可溶性糖

饅頭是一種具有悠久歷史的中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，以小麥粉為主要原料，將小麥粉加水、酵母或面肥、老面、起子、酵汁等起發(fā)劑，攪拌揉和成面團，經發(fā)酵、揉制、成型、醒發(fā)等處理，再經汽蒸熟化定形的小麥面制食品[1]。饅頭面團發(fā)酵過程中會發(fā)生一系列化學變化：在α-淀粉酶作用下淀粉生成糊精、麥芽糖，再由酶的分解作用生成葡萄糖，葡萄糖經發(fā)酵生成丙酮酸，然后在酵母菌作用下脫掉CO2，生成乙醛，最后被還原為乙醇，使饅頭具有淡淡酒香味，其中產生的CO2作用于面筋結構，影響?zhàn)z頭體積[2-3]。

民間采用傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵制作饅頭出現于13世紀[4]，隨著面包酵母的發(fā)明及其帶來的極大方便性，其逐漸取代了傳統(tǒng)發(fā)酵劑。傳統(tǒng)饅頭發(fā)酵劑是自然接種的，除含有酵母菌外，還含有一定數量和種類的其他微生物群，發(fā)酵過程中會產生二氧化碳、乙醇、乳酸、醋酸等物質以及少量的風味輔助物質，其中酵母菌和乳酸菌的代謝作用使醇和酸進一步發(fā)生酯化反應，生成一定數量的酯類，還會形成極少量的醛、酮類等[4-5]。與純酵母發(fā)酵的饅頭相比，多菌種混合發(fā)酵的饅頭香味較濃且風味獨特，深受人們的喜愛[4]。

國外研究發(fā)現，應用接種純菌發(fā)酵的酸面團發(fā)酵面包能夠改善面包的風味、質構，延遲老化，并防止因霉菌和細菌引起的腐敗，從而延長面包貨架期等[6-7]。有學者對酸面團或傳統(tǒng)面包制作過程中微生物的生長、酸度和糖的變化進行了研究[7-9]。自20世紀中期以來，國內的科學家圍繞饅頭進行了一定的研究，但技術應用研究多于基礎研究[10]，近年雖然在饅頭的分類[10]、饅頭國標的制定[11]，傳統(tǒng)饅頭發(fā)酵劑[4,12]等方面取得部分成果，但仍有待進行深入系統(tǒng)的研究。

采用活性干酵母發(fā)酵饅頭面團時，添加酵母菌和/或乳酸菌發(fā)酵的老面團，以達到混合發(fā)酵的效果，但饅頭面團發(fā)酵過程中微生物的生長代謝還未見相關報道。所以本實驗采用純菌接種發(fā)酵老面團，然后添加到饅頭面團中進行混合發(fā)酵，進而研究饅頭面團發(fā)酵過程中微生物生長、pH值和滴定酸(TTA)的變化及可溶性糖含量的變化，為進一步研究菌種混合發(fā)酵對饅頭品質的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉 北京大磨坊面粉有限公司；酵母菌(Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.0562)、乳酸菌(Lactobacillus brevis CGMCC 1.0579) 中科院微生物研究所。

蔗糖 北京化工廠；葡萄糖 北京益利精細化學品有限公司；D(-)-果糖 北京欣經科生物技術有限公司；D(+)麥芽糖 Sigma公司；乙腈(色譜純)、去離子水、三氯乙酸(分析純)。

1.2 儀器與設備

Agilent-1100高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；2000蒸發(fā)光散射檢測器( ELSD) 美國奧泰科技( 中國)有限公司；醒發(fā)箱 珠海三麥機械有限公司；電子分析天平 奧豪斯國際貿易(上海)有限公司；KQ2100DE型超聲波清洗器(40kHz) 昆山市超聲儀器有限公司；0.22μm微孔濾膜。

1.3 方法

1.3.1 老面團的制備

200g面粉、300mL水其中包括50mL酵母菌和/或乳酸菌菌懸液(106～107CFU/mL)，Saccharomyces cerevisiae 2.0562 和 Lactobacillus brevis 1.0579 分別單一接種或二者混合發(fā)酵。混合均勻后于24℃發(fā)酵24h[13]。

1.3.2 饅頭制作

采用軟式主食饅頭發(fā)酵方法：添加質量分數為20%(面粉基)的老面團，同時添加質量分數為0.5%即發(fā)干酵母[13]。50g老面團、20mL水、0.5g即發(fā)干酵母、70g饅頭專用粉，用手混勻后，形成光滑完整的面團。將面團置于溫度為(32±2)℃，相對濕度為85%的醒發(fā)箱中發(fā)酵40min。取出添加10g面粉揉成半圓型面團，同以上發(fā)酵條件醒發(fā)20min。采用直徑33cm的不銹鋼鍋，加入1800mL水，加熱至沸騰后將饅頭坯放在蒸箅上，蓋嚴，沸水汽蒸20min，停火2min后，取出饅頭，20min后用于測定。以未添加老面團為對照組。在饅頭面團混合完成、第一次發(fā)酵完成時(40min)、翻新后、醒發(fā)完成時(醒發(fā)20min)、饅頭冷卻后分別取樣測定。

1.3.3 微生物計數

用無菌移液管準確吸取1.3.1 節(jié)老面團制備中的菌懸液1mL，加無菌水9mL 進行稀釋。10g面團與90mL無菌水用超聲波振蕩儀混合2min，進行10倍等梯度系列稀釋。取適當濃度梯度稀釋液各0.1mL，分別接種到MRS培養(yǎng)基(含0.1g/L放線菌酮)[9,14-15]和麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基平板，每個梯度做兩個平行, 于30℃和28℃倒置培養(yǎng)3d進行微生物計數[16]。

1.3.4 pH值和TTA值的測定

10g樣品與90mL無菌水用超聲波振蕩儀混均，用pH計測定[15]。用0.1mol/L NaOH滴定至pH8.5，記錄所消耗的0.1mol/L NaOH的體積即為TTA值[9]。

1.3.5 可溶性糖的測定

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱：Prevail Carbohydrate ES Columns (250mm×4.6mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(體積比70:30)，使用前經0.45 μm濾膜過濾)；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；ELSD參數：漂移管溫度83.5℃，載氣流速2.2L/min；進樣量：10μL。

1.3.5.2 標準曲線的制作

準確稱取 (精確至0.0001g)干燥至質量恒定的麥芽糖0.2g(質量濃度約為4mg/mL)、果糖、葡萄糖、蔗糖各0.05g(質量濃度約為1mg/mL)，分別用純凈水定容于50mL 容量瓶中。用自動進樣器分別注入1、3、5、7、10μL 4種糖的標準溶液，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，分別繪制標準溶液曲線，計算線性回歸方程。同時配制果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的混合標準溶液，使各糖的質量濃度均約為1mg/mL，進樣量10μL作為標準品色譜圖[17]。

1.3.5.3 樣品測定

準確稱取樣品25g(精確至0.0001g)，置于100mL容量瓶中，加水約50mL，超聲提取20min，慢慢加入質量分數50% 三氯乙酸溶液5mL，用蒸餾水定容至刻度、混勻，靜置30min，用干燥濾紙過濾，棄去初濾液數毫升，濾液離心(8000×g，20min，4℃)，經0.22μm微孔濾膜過濾，待上機[17]。

制備好的樣液10μL注入高效液相色譜，在1.3.5.1節(jié)測定條件下記錄果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的峰面積，依據保留時間分別用外標法計算各組分的質量濃度，再計算樣品中各組分的含量。

2 結果與分析

2.1 微生物數量的變化

老面團的接種量約為106～107CFU/g，發(fā)酵完成后酵母菌和乳酸菌的數量分別為108CFU/g和109CFU/g(濕基)。分別在饅頭面團混合完成(0h)、第1次發(fā)酵完成時(40min)、翻新后、醒發(fā)完成時(20min)分別取樣進行饅頭面團發(fā)酵過程微生物計數，結果發(fā)現：剛混合后添加老面團的樣品中酵母菌的數量為106CFU/g(濕基)，對照組中酵母菌的數量為105CFU/g；同一樣品不同發(fā)酵時間取樣，菌種數量為同一數量級。雖然添加接種酵母菌的老面團樣品中已含有一定數量酵母菌，但混合饅頭面團時樣品都添加了等量的活性干酵母，同時酵母菌的繁殖速度相對較慢，再加上饅頭面團的整個發(fā)酵時間較短，所以不同時間取樣甚至不同樣品之間酵母菌的數量相差不大。對于細菌主要是乳酸菌，添加老面團的樣品中細菌數量遠大于對照組，添加老面團的饅頭面團剛混合后細菌數量約107CFU/g，隨后不同發(fā)酵時間取樣均為108CFU/g；而對照組中細菌的數量由剛混合后的103CFU/g到醒發(fā)完成增加到104CFU/g。對照組中細菌的來源主要是面粉中原有的或外界帶入的，添加老面團的饅頭面團中細菌(主要是乳酸菌)的數量較高是由于接種的乳酸菌快速繁殖，使得相應的饅頭面團中細菌的數量遠高于對照組。

通過對課程教學整體設計的改革及研究，即對課改的整體思路、方法進行了全面的認知和學習。在進行課程設計時要對學生未來可能的職業(yè)進行分析，確定本課程的能力目標，再圍繞能力目標進行項目設計。要注意培養(yǎng)學生學習興趣，教學內容要來自實際工作項目，與具體工作任務掛鉤；要關注學生的個體差異，促使人人發(fā)展。

2.2 pH值和TTA的變化

由酵母菌、乳酸菌分別單一和二者混合發(fā)酵老面團，以上3種老面團發(fā)酵完成后，pH值分別由0h的6.57、6.83和6.70降低到5.85、4.33和4.49，TTA值由0h的1.40、1.22和1.38增加到4.25、4.64和5.31。

如圖1a所示，饅頭面團發(fā)酵過程中，除酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵的樣品翻新過程中pH值略有上升；其他3個樣品的pH值都是隨著發(fā)酵時間的延長pH值稍有降低或不變；但經汽蒸熟化的饅頭成品的pH值都升高。圖1b TTA值的變化與pH值的變化趨勢大致相對應，接種混合菌種的樣品發(fā)酵過程中TTA值升高，翻新過程中降低，醒發(fā)中又升高；對照組與添加接種單一酵母菌發(fā)酵老面團的樣品的變化趨勢相同，只是TTA值較低。總體來看，發(fā)酵過程中對照組的酸度始終最低，其次為接種單一酵母菌的樣品，第三是接種混合菌種的樣品，而接種單一乳酸菌的樣品酸度最高。

明顯看出，添加酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵老面團的樣品，翻新過程中pH值和TTA值的變化與其他3個樣品不同，可以推測酵母菌和乳酸菌在生長和代謝過程中存在相互作用、相互影響，可能是乳酸菌的酸化作用促進酵母菌的發(fā)酵，同樣酵母菌發(fā)酵及代謝產物又會影響乳酸菌的生長代謝；汽蒸后所有樣品的pH值升高，TTA值下降，樣品的酸度主要受細菌(主要是乳酸菌)代謝產酸的影響，如乳酸菌、醋酸菌等代謝會產生乳酸、醋酸等有機酸，可能汽蒸過程中隨著溫度的升高酸類揮發(fā)導致樣品汽蒸后酸度降低。

圖1 添加酵母菌2.0562和/或乳酸菌1.0579發(fā)酵老面團的饅頭面團發(fā)酵過程中pH值和TTA值變化Fig.1 Changes in pH and total acidity of Mantou dough with the addition of Laomiantuan fermented by Saccharomyces cerevisiae(CGMCC 2.0562) and/or Lactobacillus brevis (CGMCC 1.0579)

2.3 可溶性糖的變化

2.3.1 可溶性糖標準回歸方程

分別取各可溶性糖的標準工作液，以可溶性糖質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行回歸計算得標準曲線回歸方程，結果見表1，4種可溶性糖標準品的混合液高效液相色譜圖見圖2。

表1 回歸方程、相關系數和線性范圍Table 1 Regression equations and their correlation coefficients and linear ranges for determining maltose, sucrose, fructose and glucose

圖2 4種可溶性糖標準品的混合液高效液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of a mixture of maltose, sucrose, fructose and glucose standards

2.3.2 樣品中可溶性糖含量的分析

取一待測的樣品提取液重復進樣5次，測定峰面積，并計算相對標準偏差(RSD)來考查其測定的精密度，得出果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的RSD分別為3.43%、2.74%、1.37%、1.28%，說明精密度良好。饅頭發(fā)酵過程中可溶性糖含量變化見圖3。

如圖3a所示，總體來看，添加單一乳酸菌發(fā)酵老面團的樣品麥芽糖含量最高，其次是酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵的，第三是對照組，而單一酵母菌發(fā)酵的樣品麥芽糖含量最低。第1次發(fā)酵過程中，除對照組無明顯變化外其他樣品中麥芽糖的含量都有下降；經過翻新后，由于新鮮面粉的添加及酶的作用除接種酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵組外，麥芽糖含量都略有增加；第2次醒發(fā)中，只有對照組中麥芽糖含量上升，其他3個樣品含量下降，因為發(fā)酵過程會發(fā)生以下反應：淀粉在α-淀粉酶作用下糊化生成麥芽糖，然后由酶的分解作用生成葡萄糖，再被酵母菌所消耗利用[2]，所以可能是對照組中生成麥芽糖的速率大于其被分解和消耗的速率，而其他樣品中情況相反。經汽蒸熟化后，所有樣品中麥芽糖的含量都有很大的增加，可能是汽蒸過程中隨著溫度升高，酶的活性增大，淀粉糊化作用增快生成更多麥芽糖，當達到一定溫度后酶失活。

如圖3b可以看出，蔗糖可以被快速消耗烈殆盡，第1次發(fā)酵完成后所有樣品中蔗糖的含量都降為零，很可能是酵母轉化酶能把蔗糖水解為葡萄糖和果糖這一原因引起的；但汽蒸熟化后各樣品中蔗糖的含量又上升到與面團混合時大致相同的含量。還可以看出，發(fā)酵過程中4個樣品中蔗糖的變化趨勢一致，只是初始及最終糖含量大小有所不同。

如圖3c所示，第1次發(fā)酵過程中，添加老面團的樣品葡萄糖含量都下降，其中添加單一酵母菌發(fā)酵老面團的樣品下降最多即發(fā)酵完成時葡萄糖含量降為零；經翻新后，添加有乳酸菌發(fā)酵的老面團樣品糖含量有所上升，但醒發(fā)階段含量有所下降；同樣汽蒸過程中所有樣品的葡萄糖含量都增加。對照組中，汽蒸前葡萄糖含量無明顯變化，僅汽蒸后含量增加。由此看出乳酸菌的存在影響酵母菌對葡萄糖的代謝，從而影響樣品中糖含量的大小及變化。

如圖3d所示，對照組中果糖的含量呈逐漸上升趨勢；其他樣品都是在第1次發(fā)酵和醒發(fā)過程中果糖含量下降，而在翻新和汽蒸后果糖含量上升。同麥芽糖、蔗糖和葡萄糖一樣，果糖也是在添加單一酵母菌發(fā)酵的老面團樣品中的含量始終最低。

圖3 饅頭發(fā)酵過程中可溶性糖含量的變化Fig.3 Changes in the contents of maltose, sucrose, fructose and glucose during Mantou fermentation

3 結 論

3.1 發(fā)酵過程中對照組的酸度始終最低，其次為接種單一酵母菌的樣品，第三是接種混合菌種的樣品，而接種單一乳酸菌的樣品酸度最高；可能酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵過程中會相互影響，所以添加二者混合發(fā)酵老面團的樣品，翻新過程中pH值和TTA值的變化與其他樣品不同；可能是因為酸的揮發(fā)性導致汽蒸后樣品的酸度降低。

3.2 實驗確定了可溶性糖的檢測條件：HPLC色譜柱Prevail Carbohydrate ES Columns，柱溫25℃，流動相乙腈-水(體積比70:30)，流速1.0mL/min，檢測器ELSD，漂移管溫度83.5℃，載氣空氣流速2.2L/min。果糖、葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的RSD分別為3.43%、2.74%、1.37%、1.28%，說明精密度良好。

3.3 添加單一乳酸菌發(fā)酵的老面團的樣品各可溶性糖含量最高，其次是酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵組，第三是對照組，而單一酵母菌發(fā)酵的樣品中可溶性糖含量最低；同樣不同菌種發(fā)酵的樣品，可溶性糖含量的變化也存在差異，由此看出不同菌種發(fā)酵影響樣品中可溶性糖的含量及變化。由于汽蒸過程中隨著溫度升高，酶的活性增大使得淀粉糊化作用增快，所以汽蒸后所有樣品中4種糖的含量都增加。

總之，添加不同菌種發(fā)酵老面團的饅頭面團和對照組在發(fā)酵過程中pH值、TTA值及麥芽糖、葡萄糖、蔗糖和果糖含量的大小和變化趨勢存在差異，由此推測接種不同菌種對原料的代謝和影響不同。不同樣品中酸度和糖含量不同，可能會影響?zhàn)z頭面團結構、代謝產物的產生，最終導致不同菌種發(fā)酵的饅頭品質存在差異。

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Metabolism of Yeast and Lactic Acid Bacteria during Dough Fermentation of Mantou

SU Dong-min1，HU Li-hua1，SU Dong-hai2,*， XIN Xiu-lan2，LI Zi-hong1
(1. College of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450052, China；2. Beijing Vocational College of Electronic Science, Beijing 100029, China)

When mixing dough of Mantou, 20% Laomiantuan fermented by Saccharomyces cerevisiae (CGMCC 2.0562) and/or Lactobacillus brevis (CGMCC 1.0579) was added in dough. The pH, total acidity and soluble sugars were determined to explore the growth and metabolism characteristics of microorganisms during dough fermentation of Laomian Mantou. Soluble sugars including maltose, sucrose, fructose and glucose were determined using high performance liquid chromatography (HPLC) with evaporative light scattering detector (ELSD). The detection conditions were as follows: mobile phase, acetonitrile/water mixture(70:30, V/V); flow rate 1.0 mL/min; column temperature, 25 ℃; ELSD drift tube temperature, 83.5 ℃; and flow rate of carrier gas,2.2 L/min. Compared with the control group, the samples with the addition of Laomian exhibited a lower pH and higher total acidity, especially the samples with addition of Laomian derived solely from Lactobacillus brevis (CGMCC 1.0579). The contents of soluble sugars and corresponding change trend differed in different samples with the addition of different Laomian starters during the fermentation. Therefore, acid-producing metabolism and soluble sugar content during the fermentation of dough may affect the quality of Mantou.

Mantou dough；yeast；lactic acid bacteria；high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detector (HPLC-ELSD)；soluble sugars

TS211.4

A

1002-6630(2010)13-0200-05

2010-01-09

北京市自然科學基金項目(5093026)；北京市教委科技計劃面上項目(KM200900002003)；

河南省重點科技攻關項目 (0523011000)

蘇東民(1963—)，男，副教授，博士，研究方向為農產品谷物加工利用及中國傳統(tǒng)主食工業(yè)化。

E-mail：dongminsu@yahoo.com.cn

*通信作者：蘇東海(1965—)，男，教授，博士，研究方向為生物技術在農產品加工中的應用。E-mail：sdhpost@126.com