宋 茹，韋榮編，謝 超，汪東風(fēng)*

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316004；3.中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210018)

黃鯽(Setipinna taty)蛋白酶解液的抑菌活性及穩(wěn)定性研究

宋 茹1,2，韋榮編2,3，謝 超2，汪東風(fēng)1,*

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.浙江海洋學(xué)院食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 舟山 316004；3.中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210018)

以黃鯽為原料測(cè)定其氨基酸組成，比較風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解黃鯽蛋白所得酶解液對(duì)大腸桿菌的抑菌作用，并對(duì)抑菌效果最強(qiáng)的蛋白酶酶解液進(jìn)行抑菌穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明：黃鯽蛋白必需氨基酸含量豐富，其中胃蛋白酶的水解液對(duì)大腸桿菌抑菌作用強(qiáng)，相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在3000～1000；黃鯽胃蛋白酶酶解液對(duì)熱穩(wěn)定，酸性低pH值可增強(qiáng)其抑菌效果，可耐受胰蛋白酶和β-內(nèi)酰胺酶處理，該酶解液有作為天然抗菌劑應(yīng)用的前景。

黃鯽；蛋白酶解液；抑菌活性；穩(wěn)定性

在抗生素濫用、耐藥菌株不斷產(chǎn)生的今天，國(guó)內(nèi)外學(xué)者掀起了抗菌肽的研究熱潮，人們?cè)诓粩鄬ふ倚碌目咕?，探索抗菌肽新的作用機(jī)制。蛋白酶解法制備抗菌肽有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)過(guò)程容易控制等優(yōu)點(diǎn)，該方法可能是大批量生產(chǎn)抗菌肽最有前途的方法[1]。通過(guò)酶解乳源蛋白、卵白蛋白、牡蠣蛋白，已經(jīng)從酶解液中分離得到多種新型抗菌肽[2-7]。

黃鯽(Setipinna taty)是我國(guó)南海、東海、黃海、渤海海域常年捕獲、產(chǎn)量較大的一種小型魚(yú)[8]，因?yàn)槠淙獗?、刺多，目前綜合加工利用程度低。有關(guān)黃鯽蛋白加工利用的研究還未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究黃鯽不同蛋白酶酶解液的抑菌作用及抑菌酶解液的穩(wěn)定性，旨在為黃鯽蛋白酶解液的抗菌應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黃鯽購(gòu)于舟山南珍水產(chǎn)市場(chǎng)。

胃蛋白酶、木瓜蛋白酶 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司；牛血清白蛋白、抑肽酶、VB12、氧化型谷胱甘肽、β-內(nèi)酰胺酶、L-肌肽、氨芐青霉素；其余試劑為分析純。

DS-1型高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；PP-20型pH計(jì) 德國(guó)賽多利斯公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LDZX-40BI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；HWS型智能生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Himae CF 16 RX型多功能離心機(jī)、UV-1200型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、835-50氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；KTAPurifier 100蛋白純化系統(tǒng) 瑞典GE公司。

1.2 方法

1.2.1 黃鯽氨基酸組成分析

取黃鯽脫水干樣10mg，加入6mol/L HCl溶液，充氮?dú)夂?，熱融密封?10℃烘箱中水解24h，脫酸后，用水定容至適當(dāng)濃度，用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.2.2 黃鯽蛋白酶解液的制備

－20℃凍藏黃鯽用流動(dòng)水進(jìn)行解凍，去頭和內(nèi)臟，去離子水清洗干凈，魚(yú)體切成碎塊用組織搗碎機(jī)搗碎(經(jīng)測(cè)定蛋白質(zhì)和脂肪含量分別為(72.45±0.60)%和(24.83±1.32)%(干質(zhì)量)，按照魚(yú)糜質(zhì)量10倍比例加入去離子水，振蕩混合，然后用6mol/L HCl溶液和6mol/L NaOH溶液調(diào)混合漿液pH值至實(shí)驗(yàn)蛋白酶最適pH值，在實(shí)驗(yàn)用酶最適酶解溫度下保溫10min，根據(jù)魚(yú)糜質(zhì)量按1000U/g比例加入蛋白酶，攪拌均勻。反應(yīng)過(guò)程中用酸和堿調(diào)節(jié)pH值以保持混合漿液pH值在各蛋白用酶最適pH值范圍內(nèi)。酶解時(shí)間5h，反應(yīng)結(jié)束后，酶解液經(jīng)95～100℃加熱10min鈍化滅酶，再用酸堿調(diào)節(jié)漿液pH值至中性，酶解液經(jīng)低溫(4℃)7000r/min離心10min，棄去上層油膜和底部殘?jiān)糁虚g清液，－20℃保藏備用。

1.2.3 黃鯽蛋白酶解液的抑菌作用

根據(jù)文獻(xiàn)[9]吸光度法略加修改，分別在5mL 肉湯液體培養(yǎng)基中加入各蛋白酶酶解液1mL(預(yù)先調(diào)節(jié)各酶解液蛋白質(zhì)濃度一致，并用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌)和0.1mL指示菌——大腸桿菌菌懸液(菌齡為18～24h，菌濃度107CFU/mL)，混合均勻，37℃培養(yǎng)24h ，以5mL 肉湯液體培養(yǎng)基和1mL 滅菌生理鹽水混合液為空白調(diào)零，測(cè)定樣品在波長(zhǎng)570nm處吸光度(A樣品)，同時(shí)測(cè)定樣品空白和對(duì)照的吸光度。樣品空白(A樣空)不加菌懸液，其余條件相同；對(duì)照(A對(duì)照)用1mL 滅菌生理鹽水代替1mL蛋白酶解液，其余條件相同。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，計(jì)算蛋白酶解液抑菌率。

1.2.4 具有抑菌作用的黃鯽蛋白酶解液相對(duì)分子質(zhì)量分布

1.2.5 抑菌圈法

根據(jù)文獻(xiàn)[10]瓊脂擴(kuò)散法略加改進(jìn)，培養(yǎng)皿中加入100μL活化好的大腸桿菌菌懸液(菌齡為18～24h，濃度為106～107CFU/mL)，然后加入45～50℃左右營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15mL，充分混合均勻，待瓊脂凝固后，用滅菌打孔器(直徑4mm)打孔，每孔加入經(jīng)過(guò)濾除菌的酶解液25μL，37℃培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.6 黃鯽蛋白酶解液抑菌穩(wěn)定性

熱穩(wěn)定性：采用抑菌圈法測(cè)定黃鯽胃蛋白酶酶解液經(jīng)80、90、100、121℃分別加熱15、30min后酶解液的抑菌圈直徑大小，未經(jīng)加熱處理樣品為對(duì)照，抑菌效果記作100%。

pH值穩(wěn)定性：質(zhì)量相同的黃鯽胃蛋白酶酶解液凍干粉，分別用pH2.4、3.4、4.4、5.4、6.4、7.4、8.4、9.4的甘氨酸-HCl或Tris-HCl緩沖液溶解，室溫靜置30min，抑菌圈法測(cè)定不同pH值下的抑菌圈直徑。

對(duì)胰蛋白酶穩(wěn)定性：黃鯽胃蛋白酶酶解液與等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶(酶活力2500U/mg)混合，在37℃水浴分別作用1、2、3、4、5h，然后95℃加熱滅酶10min，抑菌圈法測(cè)定抑菌結(jié)果，其中未經(jīng)胰蛋白酶水解的黃鯽胃蛋白酶酶解液抑菌結(jié)果記作100%。

對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性：黃鯽胃蛋白酶酶解液與適量β-內(nèi)酰胺酶混合，室溫下作用30min，然后采用抑菌圈法測(cè)定菌結(jié)果，氨芐青霉素與β-內(nèi)酰胺酶混合后的抑菌結(jié)果為對(duì)照。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示(n=3)，采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟處理數(shù)據(jù)，應(yīng)用t-test 檢驗(yàn)組間差異顯著性，P＜ 0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃鯽蛋白的氨基酸組成分析

表1 黃鯽蛋白氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of half-fin anchovy g/ 100g(干質(zhì)量)

黃鯽蛋白水解液共檢測(cè)出16種氨基酸(表1)，其中必需氨基酸7種。含量最高的氨基酸是與鮮味有關(guān)的谷氨酸(13.14%)和天冬氨酸(7.63%)，此外賴(lài)氨酸含量也較高(6.30%)，含量最低氨基酸是組氨酸(1.39%)。黃鯽氨基酸總量為樣品質(zhì)量的74.41%，其中ΣEAA/ΣAA和ΣEAA/ΣNEAA比值分別為0.51和1.04，高于FAO/WHO建議值0.40和0.60[11]，說(shuō)明黃鯽蛋白是一種優(yōu)質(zhì)蛋白，以該蛋白質(zhì)為基物，通過(guò)酶解法制備的抗菌酶解液營(yíng)養(yǎng)均衡，有作為功能型抗菌劑的應(yīng)用前景。

2.2 黃鯽蛋白酶解液的抑菌結(jié)果比較制備抗菌酶解液的實(shí)驗(yàn)用酶和酶解條件也不一定相同。實(shí)驗(yàn)選用風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶為實(shí)驗(yàn)用酶，以大腸桿菌為指示菌，吸光度法測(cè)定各酶解液的抑菌作用，結(jié)果如圖1所示。

黃鯽經(jīng)不同蛋白酶水解后，胃蛋白酶的酶解液對(duì)大腸桿菌的抑菌效果最強(qiáng)，其次為胰蛋白酶，而風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶解液對(duì)大腸桿菌表現(xiàn)出不同程度的促生長(zhǎng)作用(圖1)。胃蛋白酶和胰蛋白酶均為專(zhuān)一性強(qiáng)的內(nèi)切酶，胃蛋白酶斷裂點(diǎn)兩側(cè)的殘基要求都是疏水性(或非極性)氨基酸，如：Phe、Leu、

Trp、Tyr等[12]。胰蛋白酶只斷裂Arg、Lys羧基參與形成的肽鍵[12]，其中富含精氨酸的肽特有的陽(yáng)離子和氫鍵特性有利于與菌體細(xì)胞膜上大量的陰離子組分結(jié)合，進(jìn)而生成膜擬態(tài)結(jié)構(gòu)達(dá)到抑菌效果[13]。具有抗菌作用的肽類(lèi)一級(jí)結(jié)構(gòu)比較相似，N端富含賴(lài)氨酸和精氨酸等陽(yáng)離子型氨基酸，C端富含丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸等非極性氨基酸，中間部分則富含脯氨酸[14-15]。抗菌肽的抗菌機(jī)理主要分為膜損傷和非膜損傷兩大類(lèi)，但不管哪種抗菌機(jī)制，抗菌分子首先要結(jié)合到細(xì)胞膜上，而酶解液中疏水性殘基片段越多，越有利于與細(xì)胞膜上的親脂蛋白結(jié)合，而后再通過(guò)特定的抗菌方式實(shí)現(xiàn)抗菌作用。

2.3 具有抑菌作用的黃鯽蛋白酶解液相對(duì)分子質(zhì)量分布黃鯽胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶解液具有抑菌作用，其凝膠分離色譜圖和各分離峰所對(duì)應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量范圍分別見(jiàn)圖2和表2。

圖2 黃鯽胃蛋白酶酶解液(a)和胰蛋白酶酶解液(b)的凝膠分離色譜Fig.2 Gel filtration chromatograms of half-fin anchovy hydrolysatesseparately derived from pepsin and trypsin digestion

圖1 黃鯽5種蛋白酶酶解液的抑菌率比較Fig.1 Comparison of antibacterial activities among half-fin anchovy hydrolysates derived from 5 kinds of proteases

據(jù)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的蛋白酶解液均表現(xiàn)出一定的抑菌作用。不同蛋白質(zhì)，指示菌不同，酶解法

表2 黃鯽胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解液的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍Table 2 Relative molecular mass distribution of half-fin anchovy hydrolysates separately derived from pepsin and trypsin

由圖2可知，黃鯽胃蛋白酶的酶解液主要有5個(gè)分離峰，胰蛋白酶的酶解液有6個(gè)分離峰，但從各峰對(duì)應(yīng)的洗脫體積(表2)可以看出胃蛋白酶分離峰1、2、3、4、5分別與胰蛋白酶分離峰1、2、3、4、6的洗脫體積接近，表明具有抑菌作用的黃鯽胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶解液在相對(duì)分子質(zhì)量分布方面具有相似性。由表2結(jié)果同時(shí)可知，黃鯽胃蛋白酶和胰蛋白酶的相對(duì)分子質(zhì)量主要在3000以下，其中胃蛋白酶酶解液相對(duì)分子質(zhì)量3000～1000的含量高于胰蛋白酶酶解液，而1000～500和＜500的含量則分別低于胰蛋白酶的酶解液。黃鯽胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解液的有效抑菌成分可能屬于不同相對(duì)分子質(zhì)量范圍，進(jìn)一步的分離純化工作正在進(jìn)行中。

2.4 黃鯽胃蛋白酶酶解液抑菌影響因素研究

通過(guò)以上分析，黃鯽胃蛋白酶酶解液抑菌效果高于其胰蛋白酶酶解液效果，且從經(jīng)濟(jì)角度來(lái)看，胰蛋白酶價(jià)格高于黃鯽胃蛋白酶，故選用胃蛋白酶為實(shí)驗(yàn)用酶，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面分析(RSM)優(yōu)化出具有抑菌作用的黃鯽胃蛋白酶酶解液。在此基礎(chǔ)上，對(duì)優(yōu)化后的酶解液抑菌穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。

2.4.1 加熱溫度和時(shí)間對(duì)抑菌作用的影響

表3 不同加熱溫度和時(shí)間對(duì)黃鯽胃蛋白酶酶解液抑菌效果的影響(n=3)Table 3 Effects of heating temperature and time on antibacterial activity of half-fin anchovy hydrolysate separately derived from pepsin digestion (n=3)%

121℃加熱處理對(duì)黃鯽胃蛋白酶的酶解液抑菌結(jié)果影響最大(表3)，其中加熱15min和30min后的抑菌率分別為對(duì)照的(85.81±3.56)%和(90.32±1.41)%，但與對(duì)照抑菌率比較并無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，表明胃蛋白酶酶解液中抑菌組分對(duì)熱較穩(wěn)定。

2.4.2 pH值對(duì)抑菌作用的影響

pH值通過(guò)影響抗菌肽分子表面所帶電荷數(shù)進(jìn)而影響抗菌肽分子構(gòu)型，會(huì)增強(qiáng)或降低抑菌作用。黃鯽胃蛋白酶酶解液在不同pH值條件下的抑菌結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同pH值對(duì)黃鯽胃蛋白酶酶解液抑菌作用的影響Fig.3 Effect of pH on antibacterial activity of pepsin hydrolyzed halffin anchovy

黃鯽胃蛋白酶酶解液在pH2.4～9.4條件下對(duì)大腸桿菌均有抑菌作用(圖3)，對(duì)應(yīng)的pH2.4～9.4緩沖液本身無(wú)抑菌作用，其中在弱酸條件下(pH5.4)抑菌性最強(qiáng)。過(guò)酸或過(guò)堿會(huì)改變酶解液中抗菌組分的電荷數(shù)，而電荷數(shù)的改變不但影響抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)和親水性，同時(shí)還改變了抗菌肽的三級(jí)結(jié)構(gòu)、在水溶液和細(xì)胞膜上的存在形態(tài)[16-17]，進(jìn)而會(huì)影響到抑菌性。據(jù)報(bào)道富含組氨酸的陽(yáng)離子型抗菌肽LAH4在中性條件下抗菌性一般，但在在酸性條件下抗菌性增強(qiáng)[18]?？咕腒appacin在酸性條件下30μmol/L以上即對(duì)人造脂質(zhì)體具有膜溶解性，但在中性pH值下幾乎無(wú)膜溶解性[19]。

2.4.3 胰蛋白酶對(duì)抑菌作用的影響

黃鯽胃蛋白酶酶解液進(jìn)一步用胰蛋白酶進(jìn)行二次酶解，以判定對(duì)胰蛋白酶的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 胰蛋白酶對(duì)黃鯽胃蛋白酶酶解液抑菌作用的影響(n=3)Table 4 Effect of trypsin on antibacterial activity of pepsin hydrolyzed half-fin anchovy (n=3)

黃鯽胃蛋白酶酶解液經(jīng)胰蛋白酶水解1～5h后，對(duì)大腸桿菌的抑菌結(jié)果先增加、再降低、而后又增加(表4)。專(zhuān)一性強(qiáng)的胰蛋白酶會(huì)進(jìn)一步裂解黃鯽胃蛋白酶水解液中Arg、Lys羧基參與形成的肽鍵，釋放不同的肽段。但是，黃鯽胃蛋白酶酶解液經(jīng)胰蛋白酶作用后的抑菌效果與對(duì)照比較無(wú)顯著性改變(P＞0.05)，表明具有抗菌作用的黃鯽胃蛋白酶酶解液能耐受胰蛋白酶作用，但是否生成新的抗菌片段還有待于進(jìn)一步研究。

2.4.4 黃鯽胃蛋白酶酶解液對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性

β-內(nèi)酰胺酶能專(zhuān)一性斷裂β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，具有β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的抗生素其特有環(huán)狀結(jié)構(gòu)遭到病原菌的破壞，就會(huì)失去抗菌效果產(chǎn)生耐藥性。黃鯽胃蛋白酶水解物和抗菌對(duì)照藥物氨芐青霉素對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 β-內(nèi)酰胺酶對(duì)黃鯽胃蛋白酶酶解液抑菌效果的影響Fig.4 Effect of β-lactamase on antibacterial activity of pepsin hydrolyzed half-fin anchovy

由圖4可知，黃鯽胃蛋白酶酶解液經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶處理后，對(duì)大腸桿菌仍然具有較強(qiáng)的抑菌效果，而氨芐青霉素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶作用后，抑菌作用完全喪失。說(shuō)明黃鯽胃蛋白酶酶解液的抗菌組分不含有β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，對(duì)一些耐藥菌可以發(fā)揮作用，有進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為耐藥菌抗生素的價(jià)值。

3 結(jié) 論

黃鯽氨基酸總量為樣品質(zhì)量的74.41%，其中ΣEAA/ΣAA和ΣEAA/ΣNEAA比值分別為0.51和1.04，高于FAO/WHO建議值0.40和0.60，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。經(jīng)風(fēng)味蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解后，其中的胃蛋白酶酶解液對(duì)大腸桿菌抑菌作用強(qiáng)，相對(duì)分子質(zhì)量3000～1000，含量接近70%。黃鯽胃蛋白酶的酶解液熱穩(wěn)定性高，弱酸性pH值可以增強(qiáng)其抑菌效果，并且耐受胰蛋白酶和β-內(nèi)酰胺酶處理，有作為天然抗菌劑的應(yīng)用前景。

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Antibacterial Activity and Stability of Half-Fin Anchovy (Setipinna taty) Protein Hydrolysate

SONG Ru1,2， WEI Rong-bian2,3， XIE Chao2， WANG Dong-feng1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China；2. School of Food Science and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316004, China；3. School of Life Sciences and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210018, China)

Half-fin anchovy (Setipinna taty) was determine for its amino acid composition. The antibacterial activities of halffin anchovy hydrolysates separately derived from flavor protease, trypsin, pepsin, alkaline protease and papain digestion were evaluated usingEscherichia coli. Half-fin anchovy was rich in essential amino acids. The pepsin hydrolysate exhibited the highest antibacterial activity againstEscherichia coliand its relative molecular mass ranged from 3000 to 1000. In addition, pepsin hydrolyzed half-fin anchovy also exhibited high thermal stability and enhanced antibacterial activity at lower acidic pH values.Moreover, pepsin hydrolyzed half-fin anchovy exhibited high tolerance to trypsin andβ-lactamase. Therefore, pepsin hydrolyzed half-fin anchovy appears to be a promising natural antibacterial agent.

half-fin anchovy；protein hydrolysate；antibacterial activity；stability

TS254.1

A

1002-6630(2010)13-0088-05

2009-11-12

舟山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(Y20082086)

宋茹(1976—)，女，博士研究生，主要從事食品化學(xué)和食品營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail：happysong545@yahoo.com.cn*通信作者：汪東風(fēng)(1956—)，男，教授，博士，主要從事食品與生物工程研究。E-mail：wangdf@ouc.edu.cn