宋忠魁, 蔡小輝, 童 潼, 楊家林

(廣西海洋研究所 廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 北海 536000)

廣西茅尾海常見牡蠣的分子鑒定

宋忠魁, 蔡小輝, 童 潼, 楊家林

(廣西海洋研究所 廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣西 北海 536000)

應(yīng)用COⅠ條形碼技術(shù)鑒定廣西茅尾海的3種常見牡蠣, 其俗名分別是“白眼蠔”、“紅眼蠔”和“蠔礪”。研究結(jié)果表明, 茅尾海3種牡蠣?wèi)?yīng)歸屬牡蠣科(Ostreidae)、巨蠣屬(Crassostrea), 其中“白眼蠔”是香港巨牡蠣(C.hongkongensis)、“紅眼蠔”是有明巨牡蠣(C. ariakensis)、“蠔礪”是 Kumamoto牡蠣(C.sikamea)。研究驗(yàn)證了已開發(fā)的多重PCR技術(shù)能對3種牡蠣進(jìn)行快速鑒定, 并揭示香港巨牡蠣是茅尾海優(yōu)勢種, 基本上澄清了與“近江牡蠣”相關(guān)的俗名問題。

茅尾海; 牡蠣; COⅠ條形碼; 分子鑒定

牡蠣(Ostreidae)屬軟體動物門Mollusca、雙殼綱Lamellibranchiata、珍珠貝目 Pterioida, 為世界性廣布種。牡蠣廣棲性, 貝殼可塑性強(qiáng), 因此牡蠣的多數(shù)種類單純依靠貝殼的外部形態(tài)很難精確區(qū)分。牡蠣異地引種頻繁, 不僅打破了種間地理隔離, 也人為地擴(kuò)大了種的生存空間范圍, 進(jìn)一步加劇牡蠣基于形態(tài)特征鑒定的難度。為之, 牡蠣分類學(xué)家倡導(dǎo)牡蠣物種的準(zhǔn)確鑒定應(yīng)結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)方法與分子標(biāo)記技術(shù)[1,2]。

應(yīng)用分子標(biāo)記識別牡蠣物種身份是當(dāng)前牡蠣分類學(xué)研究熱點(diǎn)之一。測序目的基因并結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析能有效地鑒定牡蠣物種。例如, 王海艷[3]應(yīng)用線粒體基因(16S和COⅠ)和核基因(28S)并結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對中國近海常見牡蠣進(jìn)行的分類研究。Reece等[4]認(rèn)為分子系統(tǒng)發(fā)育分析有助于澄清牡蠣分類的爭議問題, 利于異地引種。某些目的基因譬如ITS區(qū)在一些牡蠣種間的長度本身差異顯著, 所以其本身的長度多態(tài)性可以應(yīng)用于牡蠣種的鑒定。Wang和Guo[5]認(rèn)為ITS1和ITS2的長度多態(tài)性能有效地鑒定4種牡蠣和 4組牡蠣種對。基于序列分析發(fā)展的 PCRRFLP和多重 PCR技術(shù)能對一些牡蠣種類進(jìn)行快速鑒定。ITS1-RFLP能有效地區(qū)分巨蠣屬的7個物種,COⅠ-RFLP能有效地區(qū)分巨蠣屬的 9個物種[6]。Wang和Guo[7]開發(fā)的多重PCR技術(shù)能有效區(qū)分巨蠣屬的5個物種, 無須酶切鑒定。

廣西欽州茅尾海是一個口袋形狀的內(nèi)海, 位于欽州灣的頂端, 地處東經(jīng) 108°28′33″～108°55′33″, 北緯 21°33′15″～21°54′40″, 面積 135 km2, 是我國最大的“近江牡蠣”(Ostrea rivularis)天然采苗基地。茅尾海常見牡蠣主要有3種, 俗稱“白眼蠔”、“紅眼蠔”和“蠔礪”(亦稱蠔蜊、黃蠔), 其中“白眼蠔”和“紅眼蠔”正是茅尾海蠔民眼中的“近江牡蠣”。

“近江牡蠣”的分類問題是牡蠣物種分類學(xué)爭議的焦點(diǎn)之一。多數(shù)牡蠣分類學(xué)家認(rèn)為“近江牡蠣”這一學(xué)名不應(yīng)該存在, 先前所稱的“近江牡蠣”可區(qū)分為兩個物種, 即香港巨牡蠣(Crassostrea hongkongensis)和有明巨牡蠣(C. ariakensis)[8]。再者, “近江牡蠣”與多組俗名發(fā)生聯(lián)系[3,8,9], 如“白肉”和“紅肉”, “白蠔”和“赤蠔”, “白眼蠔”和“紅眼蠔”等, 進(jìn)一步升級了“近江牡蠣”的分類問題。那么, 這些俗名到底是怎樣一種等同關(guān)系, 所有俗名的正式學(xué)名又是什么, 都有待于給出明確的答案。

鑒于牡蠣COⅠ的數(shù)據(jù)不斷累積, 因此應(yīng)用COⅠ條形碼鑒定中國近海常見牡蠣已成為可能。利用COⅠ條形碼技術(shù)鑒定茅尾海 3種牡蠣, 探討“近江牡蠣”相關(guān)俗名之間的關(guān)系, 為“近江牡蠣”的分類問題提供佐證。更進(jìn)一步驗(yàn)證多重PCR技術(shù)的快速鑒定作用, 分析茅尾海的牡蠣優(yōu)勢種, 為茅尾海牡蠣資源的保護(hù)和合理開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用牡蠣于2008年12月20日采自茅尾海增養(yǎng)殖區(qū), 隨機(jī)采樣, 收集60個個體, 來自吊養(yǎng)、立養(yǎng)兩種養(yǎng)殖方式。牡蠣物種身份經(jīng)蠔民初步判別后, 取閉殼肌, 95%乙醇固定3次, -20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

取乙醇固定后的少量閉殼肌肌肉組織(約50 mg)于1.5 mL EP管, 其余肌肉組織留作憑證, 加600 μL STE緩沖液, 使用眼科剪剪碎肌肉組織, 再加入 60μL 10%SDS和10 μL 20%蛋白酶K, 55 ℃水浴消化完全(約 2～3 h), 然后采用常規(guī)的酚-氯仿-異戊醇方法依次抽提, 使用異丙醇于-20℃沉淀DNA過夜, 70%乙醇洗滌, 空氣晾干, 50～100 μL滅菌雙蒸蒸餾水溶解, -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增與測序

合成 COⅠ條形碼的通用引物 LCO-1490(5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3')和HCO-2198(5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3')進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。在 AG 22331型 PCR 擴(kuò)增儀(Eppendorf, Germeny) 上進(jìn)行, 反應(yīng)總體積 25 μL,其中含10 ×緩沖液2.5 μL, 2.5 mmol/LdNTP 混合液1.0 μL, 2.5 mmol/L MgCl21.5 μL, DNA 模板 1 μL(＜ 50 ng), 5U/μL Taq 酶 0. 5 μL(以上試劑均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品), 引物終濃度為0.4 μmol/L,補(bǔ)足滅菌雙蒸蒸餾水至25 μL。優(yōu)化后PCR 擴(kuò)增條件為： 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性60 s, 52℃退火60 s, 72℃延伸 60 s, 30個循環(huán); 最后在 72℃延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1.0%瓊脂糖凝膠電泳, 溴化乙錠(EB)染色, 用凝膠圖像及分析系統(tǒng)(Alpha innotech,USA)觀察、照相。陰性對照組用滅菌雙蒸蒸餾水代替模板 DNA。所有 PCR反應(yīng)均獲得單一擴(kuò)增條帶,且大小與預(yù)期一致(600～700 bp之間)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送至上海生物工程有限公司測序, 擴(kuò)增引物用作測序引物。

1.2.3 序列整理與鄰接(neighbour-joining, NJ)分析

使用DNAStar軟件包中的SeqMan程序拼接序列并結(jié)合 Chromas程序判別可疑位點(diǎn), 執(zhí)行軟件包中的EditSeq程序識別引物位置并剪切引物序列。使用 Blastn搜索同源序列并確定下載序列的登陸號。擬下載的同源序列須滿足的首要條件是： 同源序列的長度至少不低于目的片段的長度。使用 Blastx確定編碼位點(diǎn)的位置。利用軟件ClustalX1.81進(jìn)行序列比對, 使用軟件MEGA3.1中的鄰接法進(jìn)行聚類分析,系統(tǒng)發(fā)育樹分支置信度使用自引導(dǎo)檢驗(yàn)(Bootstrap test)估計, 1 000次重復(fù)。

1.2.4 多重PCR基因分型

基于序列信息可以推定物種身份, 但為了再次印證物種身份, 主要為了驗(yàn)證多重 PCR是否能快速鑒定物種身份, 參考文獻(xiàn)[4], 合成5條引物, 建立多重 PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。引物信息如下：COCar183r(5'-AAAAAAGATTATAACTAATGCATGTCGG-3'), COChk 387r(5'-GGAGTAAGTGGATAAGGGTGGATAG-3'), COCsi546r(5'-AAGTAACCTTAATAGATCAGGGAACC-3'),其中 LCO-1490 和 HCO-2198 同上(示 1.2.2); 反應(yīng)體系是： 總體積 25 μL, 其中含 10 ×緩沖液 2.5 μL, 2.5 mmol/LdNTP 混合液 1.0μL, 2.5 mmol/L MgCl21.5 μL, DNA 模板 1 μL (＜ 50 ng), 5U/μL Taq 酶 0. 2 μL(以上試劑均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品), 前 3條引物終濃度為 0. 24μmol/L , 后兩條引物終濃度為0. 36 μmol/L , 補(bǔ)足滅菌雙蒸蒸餾水至25 μL; 反應(yīng)條件是： 94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃變性60 s, 52℃退火60 s, 72 ℃延伸60 s,30個循環(huán); 最后在72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳, 溴化乙錠(EB)染色, 用凝膠圖像及分析系統(tǒng)(Alpha innotech,USA)觀察、照相。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子鑒定

2.1.1 COⅠ條形碼

COⅠ條形碼技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展應(yīng)歸功于Folmer等[10]開發(fā)的一對引物L(fēng)CO-1490和HCO-2198, 該引物對的通用性極強(qiáng), 已在諸多物種類群如鱗翅目、鳥類、雙翅目等得到成功擴(kuò)增[11～13], 盡管擴(kuò)增的目的片段大小在不同物種類群間有少許差異, 譬如, 昆蟲為658 bp, 鳥類是648 bp。

已有的研究表明, COⅠ條形碼技術(shù)可用于物種鑒定和新種的發(fā)現(xiàn)[14]。本研究利用引物對LCO-1490和HCO-2198在3種牡蠣8個個體中成功擴(kuò)增出單一的COⅠ目的條帶。經(jīng)測序、序列拼接、引物剪切后, 得到的目的片段大小均為 649bp, “白眼蠔”和“紅眼蠔”個體間無序列差異, “蠔礪”兩個個體之間在序列位置 178(T→C)、343(C→A)和 373(T→C)發(fā)生堿基替換。Genbank 登錄號是 GQ214236,GQ214237, GQ214238, GQ214239, GQ214240,GQ214241, GQ214242。

利用 Blastn進(jìn)行同源搜索, 基于序列相似性(Identities)可以初步推定, “白眼蠔”是香港巨牡蠣(Crassostrea hongkongensis), “紅眼蠔”是有明巨牡蠣(C. ariakensis), “蠔礪”是Crassostrea sikamea(即Kumamoto 牡蠣)。

下載在線序列46條, 其中6條來自完整線粒體基因組, 它們的 Genbank 登錄號及其在線粒體基因組中的對應(yīng)位置分別是 EU672834(126～774)、FJ593172(126～774)、FJ593173(126～774)、EU266073(129～777)、EU672831(126～774)、AF177226(15624～16272)。超過649 bp的序列有2條, Genbank 登錄號是AF280608和AF300616。除此以外的其余序列的長度均為649 bp。序列AF300616長度為663 bp, 但其同源序列的長度只有645 bp, 鑒于AF300616與香港巨牡蠣有很近的親緣關(guān)系, 因此也納入鄰接分析。

應(yīng)用軟件MEGA3.1對53條序列執(zhí)行鄰接分析,結(jié)果示圖 1a。 圖 1a是一棵無根樹, 反應(yīng)的種間關(guān)系是 ((C.ariakensis, C.hongkongensis, C.nippona),(C.gigas, C.sikamea))與Reece等[4]的研究結(jié)果高度吻合。Reece等基于COⅠ片段重建的巨蠣屬種間關(guān)系覆蓋了現(xiàn)有巨蠣屬已知種類, 為巨蠣屬種身份的判定提供了重要參考, 即存在一個或多個未知種與已知種有更近的親緣關(guān)系。由圖 1a可以看出, “白眼蠔 ”序 列 (GQ214238, GQ214239, GQ214240)與C.hongkongensis的相關(guān)序列聚成一支, Bootstrap值高達(dá)100%, 且與參考序列中的大部分(60%, 9/15)無序列差異。結(jié)合已知的巨蠣屬種間關(guān)系可以推定,“白眼蠔”與 C.hongkongensis是同一物種。“紅眼蠔”序列(GQ214236, GQ214237)與在線序列EU007493、EU007494比較, 存在 1個堿基差異, 即在同源序列的位置46發(fā)生了T→C的轉(zhuǎn)換。從樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)來看, “紅眼蠔”與C. ariakensis是同一物種?！跋柕Z”個體之間存在的序列差異并沒有讓它們跨越種的界限。首先, 兩個個體的序列聚在一個進(jìn)化支, 并沒有分布在兩個進(jìn)化支; 其次, 兩個個體的序列只與C.sikamea的相應(yīng)序列聚成一支, Bootstrap值高達(dá)100%。憑此兩點(diǎn)以及已知的巨蠣屬種間關(guān)系可以推斷, “蠔礪”是 C.sikamea。不過, 同域分布的“蠔礪”個體間存在較大的序列差異值得進(jìn)一步研究。

2.1.2 多重PCR

簡單改動Wang和Guo[7]開發(fā)的多重PCR技術(shù),用于鑒定上述3個物種, 結(jié)果示圖1b。由圖1b可見,3個物種產(chǎn)生了不同的基因分型, 其中外引物(outer primers, LCO-1490和HCO-2198)在3個物種產(chǎn)生的內(nèi)參照帶約700 bp清晰、可辨, “紅眼蠔”的特征帶位于100～250 bp之間, “白眼蠔”的特征帶位于250～500 bp之間, “蠔礪”的特征帶位于500～700 bp之間。依據(jù)Wang和Guo的研究結(jié)果, 可以推定“紅眼蠔”是有明巨牡蠣, “白眼蠔”是香港巨牡蠣, “蠔礪”是Kumamoto牡蠣。不可否認(rèn), 當(dāng)前擴(kuò)增體系的確產(chǎn)生了非特異擴(kuò)增, 非特異擴(kuò)增帶主要出現(xiàn)在1 000～2 000 bp之間, 但并不影響本研究中3個物種的鑒定。隨機(jī)取樣采苗區(qū)3齡蠔60個個體, 隨機(jī)取樣的方式就是隨機(jī)選擇吊養(yǎng)繩和蠔柱, 應(yīng)用目前擴(kuò)增體系進(jìn)行鑒定。鑒定結(jié)果表明： (1)60個個體中,“紅眼蠔”約占 5%, “白眼蠔”占 90%左右, “蠔礪”約占5%; (2)蠔民對種的判斷與當(dāng)前分子鑒定結(jié)果 100%吻合; (3)紅眼蠔主要出現(xiàn)于吊養(yǎng)區(qū)(即鹽度較高海域), 蠔礪主要出現(xiàn)于立養(yǎng)區(qū)(即鹽度較低海域)。研究結(jié)果揭示, “白眼蠔”(香港巨牡蠣)是茅尾海采苗區(qū)優(yōu)勢種, 為茅尾?！敖迪牎痹N場建設(shè)提供了科學(xué)依據(jù)。

2.2 “近江牡蠣”的俗名問題

王海艷等[3,8]在研究“近江牡蠣”的分類問題時,曾使用過兩套俗名“白肉和紅肉”以及“白蠔和赤蠔”。從其研究結(jié)果來看, “白肉”等同于“白蠔”, 學(xué)名是香港巨牡蠣, “紅肉”等同于“赤蠔”, 學(xué)名是有明巨牡蠣(又訂名為近江牡蠣)。結(jié)合本研究可以得出如下結(jié)果：俗名“白眼蠔”、“白肉”、“白蠔”是同一物種, 即香港巨牡蠣; 俗名“紅眼蠔”、“紅肉”、“赤蠔”是同一物種,即有明巨牡蠣。但問題遠(yuǎn)不止于此, 蘇天鳳[9]在研究華南沿海增養(yǎng)殖區(qū)“近江牡蠣”時, 也有“白蠔和赤蠔”的提法, 認(rèn)為“白蠔”是香港巨牡蠣和有明巨牡蠣兩個種的混合體, “赤蠔”可能是一個新種。由此看來,蘇天鳳認(rèn)為“近江牡蠣”應(yīng)該包含3個種。顯然, 蘇天鳳提及的“白蠔和赤蠔”與王海艷等談及的“白蠔和赤蠔”不能等同, 進(jìn)一步言, 也不能等同于“白肉”和“紅肉”, 也不能等同于“白眼蠔”和“紅眼蠔”。

圖1 鄰接分析(a)和多重PCR(b)結(jié)果Fig. 1 Results of neibour-joining analysis and multi-plex PCR圖中WE, RE, HL指的是白眼蠔, 紅眼蠔和蠔礪。圖1a中枝上數(shù)值指的是自展值, 鑒定樣本的標(biāo)本號和Genbank登陸號使用加粗字體顯示。 圖1b中的“C”暗示陰性對照WE, RE, and HL represent white-eye oyster, red-eye oyster and Haoli, respectively. The numerical values on the branches denote the bootstrap values in the Fig.1a. The bold fonts are used to mark the specimen numbers and Genbank accession numbers of the detected samples. The letter“C” in the Fig.1b indicates the negative control

圖2 白眼蠔(WE), 紅眼蠔(RE)和蠔礪(HL)的形態(tài)學(xué)特征Fig. 2 Morphological characteristics of white-eye oyster, red-eye oyster and “Haoli”箭頭指出種識別的形態(tài)特征和可比較的外套膜特征The positions pointed by the arrow heads can be used for the recognition of the species identities.

蠔民一般依據(jù)如下特征辨別“白眼蠔”、“紅眼蠔”和“蠔礪”： (1)殼的形態(tài)。“白眼蠔”長形或長圓形, 右殼鱗片少; “紅眼蠔”偏于圓形或卵圓形, 右殼鱗片多,典型的右殼鱗片呈“菊花”狀(示圖2a和圖2c); “蠔礪”左殼邊緣起波浪形(圖2b)。(2)軟體部和外套膜顏色?！跋柕Z”軟體部的顏色呈黃色或黃褐色, 且外套膜的顏色亦呈黃色, 所以“蠔礪”又有“黃蠔”之稱?！鞍籽巯枴焙汀凹t眼蠔”的軟體部分呈白色或灰白色, 前者外套膜顏色偏白, 后者外套膜顏色偏黑或灰色(圖2d)。蘇天鳳描述“白蠔”和“赤蠔”軟體部顏色如下： 前者呈乳白色或灰白色, 后者呈黃褐色, 廣東陽江一帶蠔民也稱“赤蠔”為“黃蠔”。王海艷等談及的“白蠔和赤蠔”軟體部顏色如下： “白蠔”的軟體部顏色為雪白色, “赤蠔”的顏色接近褐色。單憑肉質(zhì)顏色可以推定： 蘇天鳳提及的“白蠔”對應(yīng)的可能是“白眼蠔”和“紅眼蠔”, 提及的“赤蠔”對應(yīng)的可能是“蠔礪”。但據(jù)此作出推斷畢竟偏頗, 仍需采集標(biāo)本, 重新審視形態(tài)學(xué)特征并結(jié)合分子鑒定以進(jìn)一步證實(shí)。

致謝： 感謝海南大學(xué)王愛民教授和廣西紅樹林研究中心閻冰研究員在技術(shù)和理論上給予的建議。感謝欽州市欽南區(qū)沙井養(yǎng)蠔專業(yè)合作社鐘應(yīng)橋先生在標(biāo)本采集方面給予的大力支持。

3 結(jié)論

本研究應(yīng)用COⅠ條形碼技術(shù)對茅尾海3種牡蠣進(jìn)行了有效鑒定, 印證了 Wang和 Guo開發(fā)的多重PCR技術(shù)能用于茅尾海 3種牡蠣的快速鑒定, 且推定茅尾海采苗區(qū)優(yōu)勢種是香港巨牡蠣, 基本上澄清了“近江牡蠣”的俗名問題。

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Molecular identification of the common oysters from the Maowei sea in Guangxi, China

SONG Zhong-kui, CAI Xiao-hui, TONG Tong, YANG Jia-lin
(Guangxi Key Laboratory for Marine Biotechnology, Guangxi Institute of Oceanology, Beihai 536000, China)

Sep., 30, 2009

Maowei sea; oyster; COⅠbarcodes; molecular identification

The COⅠbarcodes were used to identify three common oysters from the Maowei sea in Guangxi. Their ethnic names are white-eye oyster, red-eye oyster, and “Haoli”. Our results suggested that the three oysters should be classified as genus Crassostrea within the family Ostreidae, with the scientific names being C. hongkongensis, C.ariakensis, and C. sikamea, respectively. The exploited multiplex PCR assays were able to identify the three oysters fast and reliably, and proved to us that C. hongkongensis was the predominant species of the Maowei sea. Moreover,the combination of the molecular and morphological evidences clarified the confusion of the ethinic names concerned with Ostrea rivularis.

Q179

A

1000-3096(2010)08-0011-06

2009-09-30;

2009-11-02

廣西海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金(GKLMBTD0801)

宋忠魁(1973-), 男, 副教授, 主要從事海洋經(jīng)濟(jì)動物分子標(biāo) 記 輔 助 選 育 研 究 , 電 話 ： 0779-2057372, E-mail： songsir2003@yahoo.com.cn

(本文編輯： 張培新)