王 靜, 馬吉飛 , 苗婷婷, 李兆杰, 杜宗軍

(1. 威海出入境檢驗檢疫局, 山東 威海 264200; 2. 山東大學(xué) 威海分校 海洋學(xué)院, 山東 威海 264209)

白色噬瓊膠菌QM38β-瓊膠酶基因agaD02的克隆與表達

王 靜1, 馬吉飛2, 苗婷婷2, 李兆杰1, 杜宗軍2

(1. 威海出入境檢驗檢疫局, 山東 威海 264200; 2. 山東大學(xué) 威海分校 海洋學(xué)院, 山東 威海 264209)

從白色噬瓊膠菌(Agarivorans albus) QM38基因組中擴增到一段編碼β-瓊膠酶的DNA序列, 命名為agaD02。序列相似性分析的結(jié)果表明, 基因agaD02和弧菌Vibrio sp. JT0107 及Vibrio sp. PO-303的瓊膠酶基因具有同源性, 其相似性程度分別為98.7%和97.4%, 而同GenBank中的其他序列同源性很低。對此基因的序列進行了分析, 結(jié)果表明, 其開放閱讀框長度為2 868 bp, 編碼的蛋白質(zhì)包含955個氨基酸, 在蛋白數(shù)據(jù)庫中的編號為ABM90422, 推測其分子質(zhì)量為106 ku, 等電點為4.87。利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫資源和生物學(xué)軟件對預(yù)測的瓊膠酶蛋白序列進行了同源性分析和結(jié)構(gòu)分析。設(shè)計兩端含酶切位點的特定引物, 克隆agaD02基因, 構(gòu)建入表達載體pET24a(+), 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3), 轉(zhuǎn)化后提取質(zhì)粒進行酶切和電泳驗證, 轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)可產(chǎn)生胞外瓊膠酶。

瓊膠酶; 白色噬瓊膠菌(Agarivorans albus); 克隆; 序列分析; 表達

瓊膠(瓊脂)主要是由石花菜、江蘺等紅藻提取出來的一種多糖, 和卡拉膠、褐藻膠是目前世界上用途最廣泛的3種海藻膠。瓊膠酶能夠水解瓊膠多糖, 在這些海藻的單細胞分離、酶解破壁制備原生質(zhì)體等過程中具有重要的使用價值, 是一種海藻遺傳工程的工具酶; 同時, 瓊膠酶在分子生物學(xué)方面也多有應(yīng)用[1]。 根據(jù)瓊膠酶降解瓊脂糖的作用方式不同, 可以把它們分為兩類[2,3]： α-瓊膠酶(EC3.2.1.-),作用于瓊脂糖的 α(1→3)糖苷鍵, 產(chǎn)物為瓊寡糖(agarooligosaccharides); β-瓊膠酶(EC3.2.1.81)水解 D-半乳糖殘基和3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖殘基之間的β(1→4)糖苷鍵, 產(chǎn)物為新瓊寡糖(neoagarooligosaccharades)。在對瓊膠寡糖的研究中發(fā)現(xiàn), 這些寡糖具有多種生理活性, 一定分子量的降解產(chǎn)物具有抗炎、抗病毒、增強免疫等作用。新近的研究結(jié)果表明, 新瓊寡糖具有益生作用, 無論在體內(nèi)或者體外的厭氧環(huán)境下, 都能夠顯著促進雙歧桿菌(bifidobacteria)和乳酸桿菌(lactobacilli)的生長[4]。

自從Gran于1902年首先報導(dǎo)了能夠降解瓊膠的細菌以后, 研究者們已經(jīng)分離純化出了多種海洋細菌產(chǎn)生的瓊膠酶, 并對其酶學(xué)性質(zhì)進行了研究。1993年, Sugano等[2]提純了弧菌(Vibrio sp. JT0107)的胞外瓊膠酶。1998年, Toshiyoshi等[5]對弧菌Vibrio sp. Strain PO-303所產(chǎn)生的瓊膠酶系進行了系統(tǒng)的分離, 發(fā)現(xiàn)這個菌株能夠產(chǎn)生 4種胞外的瓊膠酶組分。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對海洋微生物研究的重視, 海藻多糖降解酶的研究蓬勃興起,多種海藻多糖降解酶得到分離純化, 其基因得到了克隆、測序和表達。1993年, Sugano等[6]從弧菌JT0107的基因組克隆了agaA基因。Ohta等[7]對來源于Agarivorans sp．JAMB-A11中的一種 β-瓊膠酶在枯草桿菌中進行了重組表達。 Dong等[8,9]克隆了弧菌Vibrio sp. Strain PO-303的agaA基因和agaC基因。2007年, Dong等[10]克隆了Vibrio sp. PO-303瓊膠酶AgaD的基因并且在大腸桿菌中將此瓊膠酶進行了表達。

作者近年來對山東近海產(chǎn)瓊膠酶的海洋細菌進行了系統(tǒng)的分離, 其中菌株 QM38產(chǎn)生的胞外瓊膠酶活力很高, 16S rDNA 序列分析表明, 此菌為白色噬瓊膠菌(Agarivorans albus)[11]。白色噬瓊膠菌是日本學(xué)者2004年首先分離鑒定的新屬新種[12]。作者報道了白色噬瓊膠菌(Agarivorans albus)QM38一條編碼 β-瓊膠酶的基因 agaD02的克隆、序列分析和表達。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

白色噬瓊膠菌 (Agarivorans albus) QM38 由本實驗室分離保存; 質(zhì)粒pMD19-T Simple購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑

UNIQ-10 柱式細菌基因組 DNA抽提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司; DNA Marker、Taq 酶、LA Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTP、BamH I、Hind III、Aat Ⅱ、DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

白色噬瓊膠菌(Agarivorans albus) QM38的培養(yǎng)采用海洋細菌 2216培養(yǎng)基; 大腸桿菌培養(yǎng)基為 LB培養(yǎng)基; 含重組質(zhì)粒(pMD19)的大腸桿菌培養(yǎng)基添加氨卞青霉素(100 mg／L); 含重組質(zhì)粒(pET24a)的大腸桿菌培養(yǎng)基添加卡那霉素(30 mg／L)。

1.4 細菌DNA的提取

細菌接種液體培養(yǎng)基, 28℃振蕩培養(yǎng)24 h, 取適當(dāng)菌液, 放入微量離心管中, 離心得到菌體, 按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明進行。

1.5 白色噬瓊膠菌QM38 agaD02基因的克隆與序列測定

1.5.1 PCR引物[13]

根據(jù) GenBank中的細菌 Vibrio sp.瓊膠酶 agaB的基因序列(序列收錄號 D21202), 設(shè)計了一對引物,交由上海生工生物工程有限公司合成。其序列如下：

正向引物 QM38-3a： 5′-CCACTTAGCACTAGAGCCCGTAA- 3′

反向引物 QM38-3b： 5′-TGTACCTAGCAGATTGCACTCCC-3′

1.5.2 PCR反應(yīng)條件

利用引物QM38-3a 和QM38-3b進行PCR擴增的條件是： 在 100 μL的 PCR 反應(yīng)體系中含有：1×PCR 緩沖液, 1.5 mmol／L MgC12, 4×dNTP 混合物各 200 μmol／L, 引物各 0.5 μmol／L, TaKaRa LA Taq 1 μL(5 U／μL), 2 μLDNA 原液。PCR 反應(yīng)條件為： 96℃ 預(yù)變性 6min; 接 94 ℃ 變性 30 s, 52 ℃復(fù)性45 s, 72℃延伸3 min, 30個循環(huán); 最后72 ℃ 溫育6 min。

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后, 直接交由上海生工生物工程技術(shù)公司進行純化和序列測定。

1.6 利用分子生物學(xué)軟件對 agaD02基因進行分析

利用Primer premier 5.0 軟件對agaD02的基因序列進行分析, 將瓊膠酶基因的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列; 利用 DNAStar 軟件分析 agaD02基因編碼的蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量與等電點; 通過 http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 網(wǎng)站對 agaD02進行序列相似性搜索, 利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫資源進行 agaD02基因及其表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析。

1.7 瓊膠酶agaD02基因的克隆與表達

1.7.1 引物設(shè)計

根據(jù)瓊膠酶agaD02基因的序列, 設(shè)計出一對引物。上游引物添加BamH I酶切位點, 下游引物添加Hind III酶切位點。下游引物不包括終止密碼子, 因為載體質(zhì)粒上有終止密碼子。

上游引物 BD02-F： 5′-GGATCCATGGTAGAAGTTATGAAATTTA-3′

下游引物 BD02-R： 5′-AAGCTTTTTTTTGTAACGAAGCATGT-3′

1.7.2 PCR擴增

PCR條件同 1.5.2, 獲得的 PCR產(chǎn)物純化后與pMD19-T Simple載體連接, 得到重組質(zhì)粒, 并進行測序分析。

1.7.3 表達質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

將上述重組質(zhì)粒, 用 BamH I/Hind Ⅲ進行雙酶切后, 電泳, 切膠回收純化, 得到瓊膠酶基因agaD02的DNA。利用連接試劑盒中的Ligation Mix將酶切好的質(zhì)粒pET24a和瓊膠酶agaD02基因進行連接后, 熱轉(zhuǎn)化至 E.coli BL21中, 涂布于含卡那霉素30 mg／L的LB培養(yǎng)平皿中, 于37 ℃培養(yǎng)過夜。

1.7.4 pET24a- agaD02表達質(zhì)粒的鑒定

挑取轉(zhuǎn)化菌單菌落, 培養(yǎng), 保存菌種, 提取表達質(zhì)粒, 利用PCR的方法進行鑒定。對PCR鑒定過的質(zhì)粒以BamH I/Hind Ⅲ雙酶切鑒定。將經(jīng)過鑒定的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21宿主細胞中, 篩選陽性克隆。

1.7.5 瓊膠酶AgaD02的誘導(dǎo)表達

從新鮮的劃線平板中挑取單克隆, 接入 2 mL含有適當(dāng)抗生素的 LB 培養(yǎng)基中, 37 ℃振蕩過夜培養(yǎng), 取1 mL培養(yǎng)液l接種入50 mL 新鮮培養(yǎng)基, 37℃搖床培養(yǎng)至A600nm到0.4～1。加入IPTG 儲液至終濃度1 mmol/L, 繼續(xù)培養(yǎng)2～3 h。然后, 取一滴培養(yǎng)液置于LB固體平板上, 37 ℃過夜培養(yǎng), 取出后用碘液染色, 定性觀察是否有瓊膠酶產(chǎn)生。

2 實驗結(jié)果

2.1 細菌QM38瓊膠酶基因的PCR擴增

利用上海生工 UNIQ-10 柱式細菌基因組 DNA抽提試劑盒提取細菌Agarivorans albusQM38基因組DNA, 利用引物QM38-3a和QM38-3b, 以基因組DNA為模板, 進行PCR擴增, 擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測,得到一條長約300 0 bp的片段, 如圖1所示。

將 PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司測序, 得到的序列長度為 3029bp, 將此序列輸入 GenBank,獲得收錄號為EF199908。將此基因命名為agaD02。

圖1 白色噬瓊膠菌QM38基因組進行瓊膠酶基因的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 PCR amplification of the agarase gene from Agarivorans albus QM38M. λ-Hind Ⅲ DNA Marker 大小分別為： 23 130, 9 416, 6 557, 4 361,2 322, 2 027, 564和125 bp; 1. QM38瓊膠酶基因agaD02的PCR結(jié)果M. λ-Hind Ⅲ DNA Marker： 23 130, 9 416, 6 557, 4 361, 2 322, 2 027,564, 125 bp; 1. Electrophoresis of PCR resulth of agarase gene agaD02

2.2 白色噬瓊膠菌 QM38瓊膠酶基因agaD02的序列分析

利用生物軟件和網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫資源對得到的序列進行了分析, 結(jié)果如下。

通過對細菌QM38的瓊膠酶基因agaD02進行序列相似性比較, 在 GenBank數(shù)據(jù)庫中, 只有兩條序列與 EF199908有相似性[13], 一條是弧菌Vibriosp.JT0107編碼 β-瓊膠酶的agaB基因, 這兩條基因相似性有98.8%; 另外一條是弧菌Vibriosp. PO-303編碼瓊膠酶的agaE基因, 相似性為 97.4%, 而和數(shù)據(jù)庫中其他的瓊膠酶基因相似性很低。從GenBank數(shù)據(jù)庫中調(diào)取相關(guān)菌株的瓊膠酶基因序列, 和白色噬瓊膠菌 QM38的瓊膠酶基因agaD02一起, 利用Mega (4.1)軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 見圖2。

由測序結(jié)果可知, 白色噬瓊膠菌agaD02基因序列包含有一個286 8 bp的讀碼框架, 對此基因進行分析發(fā)現(xiàn),agaD02基因編碼的蛋白質(zhì)包含955個氨基酸, 命名為 AgaD02, 在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的編號為ABM90422, 此蛋白由955個氨基酸組成, 預(yù)測其分子質(zhì)量為106 ku, 其等電點為4.87。通過http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ 網(wǎng)站對其信號肽結(jié)構(gòu)進行分析, 結(jié)果顯示, 在此蛋白的N末端, 存在一段信號肽序列, 最可能的位置是第1～35個氨基酸殘基。登錄 http：//www.ebi.ac.uk/interpro/, 利 用 Interpro Scan對其進行蛋白質(zhì)家族的分析。結(jié)果顯示, 由于同源結(jié)構(gòu)信息太少, 僅能推測瓊膠酶AgaD02蛋白N末端存在信號肽序列。

圖2 白色噬瓊膠菌QM38及相關(guān)菌株瓊膠酶基因的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 2 Phylogeny tree of agarase genes from Agarivorans albus QM38 and other related strains

對細菌QM38的瓊膠酶基因agaD02編碼的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)進行了初步分析, 登錄同源模建網(wǎng)站http：//swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html,利用First Approach Mode方法進行模建。結(jié)果顯示未發(fā)現(xiàn)模板, 即相關(guān)酶類還沒有建立三維結(jié)構(gòu)。

通過以上對于agaD02基因以及其編碼的蛋白質(zhì)AgaD02的研究, 可以看出, 這條基因是比較獨特的編碼瓊膠酶的基因。它所編碼的瓊膠酶, 是一個新的蛋白, 對它的結(jié)構(gòu)和功能的研究很少, 如果能進行結(jié)構(gòu)與功能的研究, 得到其催化特性, 將能夠獲得許多新的數(shù)據(jù)與材料。

2.3 QM38瓊膠酶基因的PCR擴增、克隆與重組質(zhì)粒的提取鑒定

使用前述設(shè)計的表達引物, 以細菌 QM38基因組DNA為模板進行PCR擴增, 發(fā)現(xiàn)有一條擴增片段,大小符合預(yù)期。將PCR回收產(chǎn)物與pMD19-T simple連接, 熱轉(zhuǎn)化至Escherichia coliJM109中, 涂布平板過夜培養(yǎng)菌體。挑取兩個陽性克隆菌體, 提取質(zhì)粒進行電泳檢測。對兩個陽性克隆質(zhì)粒 BD02-pMD19-1和 BD02-pMD19-2進行測序, 結(jié)果表明,BD02-pMD19- 1質(zhì)粒在agaD02基因開放閱讀框的第541和2827處發(fā)生點突變, 都是A突變?yōu)镚。這將導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)的第181位和第 943位的兩個賴氨酸變?yōu)楣劝彼帷D02-pMD19-2質(zhì)粒序列正常,可以用于下一步的亞克隆。

2.4 重組表達載體的建立、轉(zhuǎn)化與表達質(zhì)粒的鑒定

BD02-pMD19-2質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切, 回收以后, 與酶切好的pET24a(+)載體連接, 然后, 連接液轉(zhuǎn)化E.coliBL21, 涂布于含卡那霉素30 mg／L的LB培養(yǎng)平皿中, 37℃培養(yǎng)箱恒溫過夜培養(yǎng)。隨機挑取轉(zhuǎn)化菌單菌落, 培養(yǎng), 提取表達質(zhì)粒, 利用 PCR的方法進行鑒定。取PCR反應(yīng)陽性的兩個質(zhì)粒以BamH I/HindⅢ雙酶切鑒定, 進行瓊脂糖凝膠電泳驗證(圖 3)。將經(jīng)過鑒定的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21宿主細胞中, 篩選陽性克隆。

圖3 pET24a- agaD02重組載體的BamH I/Hind Ⅲ雙酶切電泳鑒定結(jié)果Fig. 3 Recombinant vector pET24a- agaD02 digested by BamH I/Hind ⅢM. λ-Hind Ⅲ DNA Marker 大小分別為 23 130, 9 416, 6 557, 4 361,2 322, 2 027, 564和125 bp; 1, 2. pET24a- agaD02表達質(zhì)粒樣本的雙酶切M. λ-Hind Ⅲ DNA Marker： 23 130, 9 416, 6 557, 4 361, 2 322, 2 027, 564, 125 bp; 1, 2. Electrophoresis of recombinant plasmids PET24a-agaD02 digested with restriction enzymes

2.5 瓊膠酶AgaD02的誘導(dǎo)表達

構(gòu)建好的表達菌株BD02, 經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)以后,在培養(yǎng)液中能夠檢測到胞外的瓊膠酶活性。培養(yǎng)平板用碘液染色觀察[14], 可以觀察到透明水解圈(圖 4),證明表達成功。

3 討論

由于瓊膠酶及其降解產(chǎn)物具有很重要的應(yīng)用價值, 近年來關(guān)于瓊膠酶的研究工作也越來越多, 新的酶蛋白不斷被分離, 新的基因也不斷被克隆得到。Sugano 等[2]對弧菌 JT0107產(chǎn)生的瓊膠酶系進行了系統(tǒng)的研究, 隨后, 他們克隆到這個瓊膠酶的基因agaA, 并且在大腸桿菌中進行了表達[6]。1994年,Sugano 等[13]從弧菌JT0107的基因組DNA克隆到另外一條編碼瓊膠酶的基因(agaB), 它編碼一個由955個氨基酸組成的瓊膠酶。另外一株弧菌, Vibrio sp.PO-303, 近年來也得到了系統(tǒng)的研究[8～10]。

圖4 含有pET24a- agaD02表達質(zhì)粒的大腸桿菌分泌出胞外瓊膠酶Fig. 4 Agarase expressed in E. coli BL21 were detected by staining the plate with Lugol’s solution

噬瓊膠菌屬 (Agarivorans) 是 2004年建立的新屬, 目前這個屬只有白色噬瓊膠菌1個種, 這個種最顯著的表型特征是能夠降解瓊膠和產(chǎn)生白色色素。2005年, Ohta等[7]從 Agarivorans sp. JAMB-A11基因組中克隆到一條編碼 β-瓊膠酶的基因, 并且在枯草芽孢桿菌中進行了表達。這條基因有298 8 bp, 編碼的蛋白由995個氨基酸構(gòu)成, 理論分子質(zhì)量為107 ku, 其核酸序列與弧菌JT0107的agaA基因有98.6%的相似性。

根據(jù)既有的研究經(jīng)驗, 一株細菌往往具有編碼多個瓊膠酶的基因序列。作者根據(jù)弧菌 JT0107的agaB基因設(shè)計引物, 成功地在 Agarivorans albus QM38細菌中克隆到 agaD02基因, 構(gòu)建表達載體,實現(xiàn)agaD02基因在大腸桿菌中的表達。這個基因的成功表達, 對于這種瓊膠酶的分離純化以及大規(guī)模生產(chǎn), 對酶蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的研究都會有推動作用。

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Cloning and expression of the beta-agarase gene agaD02 from Agarivorans albus QM38

WANG Jing1, MA Ji-fei2, MIAO Ting-ting2, LI Zhao-jie1, DU Zong-jun2
(1. Weihai Entry-Exit Inspection And Quarantine Bureau, Weihai 264200, China; 2. College of Marine Science,Shandong University at Weihai, Weihai 264209, China)

Feb., 12, 2010

aragase; Agarivorans albus; clone; sequence analysis; expression

The β-agarase gene, agaD02, was amplified by PCR using genomic DNA of Agarivorans albus strain QM38 as a template. The agaD02 gene consists of an open reading frame of 2868 bp encoding β-agarase, a protein of 955 amino acids and a molecular weight of 106 kD. The PI of the agarase is 4.87. The accession numbers for agaD02 in GenBank was EF199908. We found that the agaD02 gene shared 98.7% sequence identity to the agaB gene of Vibrio sp.JT0107 and 97.4% identity to the agaE gene of Vibrio sp. PO-303. The deduced amino acid sequence of the agaD02 gene was compared with entries in the DDBJ database. According to the sequence of agaD02 gene, a pair of primers were designed and synthesized. After PCR amplification, the product was cloned into pMD19-T simple vector using TA cloning. The recombinants were sequenced and identified by restrictive endonuclease digestion. The target gene sequences were then subcloned into a highly efficient eukaryotic expression vector pET24a(+).After confirmation by double restrictive endonuclease digestion, the expression vectors were transformed into E. coli BL21(DE3). The recombinants E. coli BL21 (pET24a-agaD02) were induced by IPTG on Petri dish and were stained with Lugol iodide solution after being cultured for 24 h at 37℃. A clear zone was observed around the colony of the recombinants E. coli, confirming that the pET24a-agaD02 expression vectors were successfully constructed.

Q936

A

1000-3096(2010)08-0006-05

2010-02-12;

2010-06-03

山東省自然科學(xué)基金項目 (ZR2009EQ009); 國家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點實驗室開放基金項目(MBSMAT-2009-07);山東大學(xué)自主創(chuàng)新基金資助

王靜 (1975-), 女, 山東威海人, 工程師, 從事海洋生物學(xué)研究, E-mail： wangjing7548@sohu.com; 杜宗軍, 通信作者, 博士,副教授, E-mail： duzongjun@yahoo.com

(本文編輯： 梁德海)