重金屬脅迫對(duì)杜氏鹽藻生長(zhǎng)及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/h1>
2010-10-23 03:02馮力霞田傳遠(yuǎn)
海洋科學(xué) 2010年10期
王 帥, 梁 英, 馮力霞, 田傳遠(yuǎn)
(1. 中國(guó)海洋大學(xué) 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003; 2. 國(guó)家海洋局第一海洋研究所 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266061)
重金屬脅迫對(duì)杜氏鹽藻生長(zhǎng)及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/p>
王 帥1,2, 梁 英1, 馮力霞1, 田傳遠(yuǎn)1
(1. 中國(guó)海洋大學(xué) 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003; 2. 國(guó)家海洋局第一海洋研究所 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266061)
研究了杜氏鹽藻Dunaliella salina在不同濃度的Cu2+、Zn2+、Cd2+等重金屬離子脅迫一段時(shí)間(24、48、72 和96 h)后, 葉綠素?zé)晒馓匦缘淖兓闆r。測(cè)定的主要參數(shù)有： PSII的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、PSII的潛在活性(Fv/Fo)、PSII的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Yield)、相對(duì)光合電子傳遞效率(rETR)、光化學(xué)淬滅(qP)和非光化學(xué)淬滅(NPQ)。研究結(jié)果表明, 當(dāng) Cu2+濃度范圍在 600～800 μmol/L時(shí), 杜氏鹽藻的Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、rETR和qP均明顯降低, NPQ變化不規(guī)律, 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 除qP在96 h時(shí)有所上升外, 各熒光參數(shù)均逐漸降低; Zn2+脅迫下Fv/Fm、Fv/Fo、Yield和rETR隨著濃度的增加而降低, NPQ先下降后上升, qP僅在Zn2+濃度范圍(800～3200 μmol/L)下明顯下降, 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 各熒光參數(shù)均逐漸降低; Cd2+脅迫下各熒光參數(shù)均明顯下降, 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), Fv/Fm、Fv/Fo和NPQ先下降后上升, 在48 h時(shí)達(dá)到最低值, Yield、rETR和qP均逐漸降低。在3種重金屬離子脅迫下, 細(xì)胞密度和葉綠素相對(duì)含量也顯著降低。根據(jù) 3種重金屬離子的半抑制濃度(EC50), 其毒性大小順序?yàn)?Cu2+＞Cd2+＞ Zn2+。
杜氏鹽藻Dunaliella salina; 重金屬脅迫; 葉綠素?zé)晒?/p>
微藻作為海洋的主要初級(jí)生產(chǎn)者在研究生態(tài)系統(tǒng)中是一個(gè)重要因素, 其光合作用的強(qiáng)弱決定了在食物鏈中可以傳遞的能量的多少。隨著海洋污染的日益嚴(yán)重, Cu2+、Zn2+、Cd2+等重金屬離子在海水中的濃度不斷增加, 微藻的光合作用過程受重金屬的影響越來(lái)越大[1～6]。因此, 研究重金屬離子對(duì)海洋微藻的毒害作用, 并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行水污染生物監(jiān)測(cè)具有十分重要的意義。
以往研究重金屬對(duì)微藻毒性的方法是將微藻置于含有不同濃度重金屬離子的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),通過測(cè)定微藻細(xì)胞密度、葉綠素含量等指標(biāo)來(lái)反映重金屬對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響。對(duì)微藻生長(zhǎng)的半抑制濃度(EC50)、半致死濃度(LC50)或刺激濃度(SC20)可以用來(lái)表示微藻對(duì)重金屬脅迫的敏感程度[6～9], 一般測(cè)定其72 h或96 h的EC50或LC50。但該法存在測(cè)量時(shí)間較長(zhǎng)、測(cè)量結(jié)果不是很準(zhǔn)確(微藻的活細(xì)胞和死細(xì)胞較難區(qū)分)等缺陷。因此, 尋找一種快速、簡(jiǎn)便、對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷的方法, 就顯得十分必要和迫切。為了解決這個(gè)問題, 國(guó)外某些學(xué)者嘗試用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)來(lái)測(cè)定重金屬對(duì)微藻的毒害作用[8,10～13], 測(cè)定的主要參數(shù)有 PSII的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、Fv'/Fm'(PSII有效光化學(xué)量子產(chǎn)量)、PSII的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Yield)、光化學(xué)淬滅(qP)、非光化學(xué)淬滅(NPQ)等, 并以某些熒光參數(shù)(Fv'/Fm'、Yield、qP等)的半抑制濃度(EC50)來(lái)表示微藻受重金屬脅迫的程度[14,15]。這種方法具有快速、準(zhǔn)確、需要樣品量少的優(yōu)點(diǎn)。但目前應(yīng)用此法開展的研究工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠, 還未見用葉綠素?zé)晒夥ㄑ芯恐亟饘匐x子對(duì)杜氏鹽藻影響的報(bào)道。
鹽藻具有很強(qiáng)的耐鹽性, 可以在含0.05～5.5 mol/L NaCl的培養(yǎng)液中生存[16], 是迄今為止最耐鹽的真核生物。其細(xì)胞內(nèi) β-胡蘿卜素、甘油和蛋白質(zhì)含量十分豐富, 含有包括人類必需氨基酸在內(nèi)的 18種氨基酸, 因此具有非常重要的商業(yè)價(jià)值。杜氏鹽藻的抗逆性很強(qiáng),近年來(lái)已被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于環(huán)境脅迫的研究[17], 作者研究了重金屬脅迫對(duì)杜氏鹽藻生長(zhǎng)及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊? 并據(jù)此計(jì)算出葉綠素?zé)晒鈪?shù)的半抑制濃度(EC50), 以期對(duì)將來(lái)培育抗逆性強(qiáng)的微藻品種及水污染生物監(jiān)測(cè)提供參考依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 藻種
實(shí)驗(yàn)所用杜氏鹽藻 Dunaliella salina (MACC/C43)藻種取自中國(guó)海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫(kù)。
1.2 微藻培養(yǎng)及重金屬脅迫
預(yù)培養(yǎng)在3 000 mL的三角燒瓶中進(jìn)行, 采用f/2培養(yǎng)基[18], 鹽度為28, 培養(yǎng)溫度為25℃±1, pH℃為8.2, 連續(xù)光照, 光強(qiáng)強(qiáng)度為4 000 lx。
實(shí)驗(yàn)在250 mL的三角燒瓶中進(jìn)行, 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果, 將 Cu2+濃度設(shè)定為 0, 100, 200, 400, 600,800 μmol/L等梯度; Zn2+濃度設(shè)定為0, 200, 400, 600,800, 1600, 3 200 μmol/L等梯度; Cd2+濃度設(shè)定為0,50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 μmol/L 等梯度。以不加重金屬的空白組為對(duì)照, 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的杜氏鹽藻以相同的接種量(9×104個(gè)/mL)分別接入上述重金屬離子濃度的培養(yǎng)液中進(jìn)行重金屬脅迫處理;每個(gè)濃度3個(gè)平行組。培養(yǎng)過程中不充氣, 每日隨機(jī)調(diào)換三角燒瓶并搖動(dòng)3～5次。分別于脅迫24, 48, 72,96 h后取樣, 進(jìn)行細(xì)胞密度(血球計(jì)數(shù)板)、葉綠素含量及葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)參數(shù)的測(cè)定。
1.3 葉綠素含量的測(cè)定
用德國(guó)Walz公司產(chǎn)Water-PAM水樣葉綠素?zé)晒鈨x(Walz, Effeltrich, Germany)進(jìn)行葉綠素含量的測(cè)定,由于瞬間熒光產(chǎn)量(F)和葉綠素濃度在一定范圍內(nèi)成正比, 通過校正可測(cè)出葉綠素含量。為避免校正過程中可能產(chǎn)生的誤差, 文中的葉綠素含量用相對(duì)含量(每次測(cè)得的葉綠素含量與接種時(shí)葉綠素含量的比值)表示。
1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定
用德國(guó)Walz公司產(chǎn)Water-PAM水樣葉綠素?zé)晒鈨x(Walz, Effeltrich, Germany)進(jìn)行葉綠素?zé)晒飧鱾€(gè)參數(shù)的測(cè)定。測(cè)量前將微藻樣品暗適應(yīng) 15 min。葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、Yield、rETR、qP和NPQ可在熒光儀上直接讀出, Fv/Fo則用公式(Fm-Fo)/ Fo計(jì)算出,其中 Fo(基礎(chǔ)熒光)用弱測(cè)量光(0.5 lx)測(cè)量可得, 用飽和脈沖(200 000 lx, 持續(xù)時(shí)間為 0.8 s)激發(fā)可得Fm(最大熒光)。
1.5 EC50的測(cè)定
EC50是指半抑制濃度, 利用機(jī)率單位法[19,20]計(jì)算得出。
1.6 統(tǒng)計(jì)分析
利用SPSS11.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2 結(jié)果
2.1 重金屬脅迫對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒飧鲄?shù)的影響
Cu2+濃度及脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響見圖1和表1。雙因子方差分析結(jié)果(表1)表明, Cu2+濃度、脅迫時(shí)間及二者的交互作用(Cu2+濃度×?xí)r間)對(duì)杜氏鹽藻各熒光參數(shù)均有顯著影響(P＜0.05), 其中 Cu2+濃度的影響最顯著。熒光參數(shù)Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、rETR、qP與 Cu2+濃度均呈顯著的負(fù)相關(guān)(表 2), 當(dāng) Cu2+濃度范圍在 600～800μmol/L, 以上各熒光參數(shù)值明顯降低。脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻各熒光參數(shù)均有顯著性影響(P＜0.05), 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 當(dāng) Cu2+濃度范圍在 600～800 μmol/L時(shí), Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、rETR 和 NPQ 均逐漸降低, 僅qP在96 h時(shí)有所上升。
Zn2+濃度及脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響見圖2和表1。雙因子方差分析結(jié)果(表1)表明, Zn2+濃度、脅迫時(shí)間及二者的交互作用(Zn2+濃度×?xí)r間)對(duì)杜氏鹽藻各熒光參數(shù)均有顯著影響(P＜0.05), 其中 Zn2+濃度的影響最顯著。熒光參數(shù)Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、rETR、qP與 Zn2+濃度均呈顯著的負(fù)相關(guān)(表 2), 當(dāng) Zn2+濃度范圍在 800～3200μmol/L時(shí), qP明顯下降, 其余各熒光參數(shù)值均隨著Zn2+濃度的增加而降低。NPQ則與 Zn2+濃度呈顯著的正相關(guān)。脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻各熒光參數(shù)均有顯著影響(P＜0.05), 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 各熒光參數(shù)均逐漸降低。
Cd2+濃度及脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響見圖3和表1。雙因子方差分析結(jié)果(表1)表明, Cd2+濃度、脅迫時(shí)間及二者的交互作用(Cd2+濃度×?xí)r間)對(duì)杜氏鹽藻各熒光參數(shù)均有顯著影響(P＜0.05), 其中 Cd2+濃度的影響最顯著。熒光參數(shù)Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、rETR與 Cd2+濃度均呈顯著的負(fù)相關(guān)(表2), 以上各熒光參數(shù)值均隨著Cd2+濃度的增加而降低。脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻各熒光參數(shù)也有顯著影響(P＜0.05), 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), Fv/Fm、Fv/Fo和NPQ先下降后上升, 在48 h時(shí)達(dá)到最低值,Yield、rETR和qP均逐漸降低。
表 3給出了杜氏鹽藻的熒光參數(shù)以及葉綠素相對(duì)含量與細(xì)胞密度之間的相關(guān)關(guān)系。由表 3可以看出, 在 Cu2+、Zn2+、Cd2+脅迫下(24～96 h), 鹽藻的熒光參數(shù)(Fv/Fm、Fv/Fo、Yield和 rETR)與細(xì)胞密度均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。特別是鹽藻的葉綠素相對(duì)含量與細(xì)胞密度呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系, 而且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 相關(guān)系數(shù)逐步增大。說明重金屬脅迫下藻細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制也能夠從部分熒光參數(shù)中得到反映。因此可以利用上述參數(shù)的變化來(lái)反映鹽藻的生長(zhǎng)情況及其對(duì)重金屬脅迫的適應(yīng)性。但鹽藻的熒光參數(shù)qP、NPQ與細(xì)胞密度的相關(guān)性不顯著。
表1 重金屬濃度和脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻熒光參數(shù)、細(xì)胞密度及葉綠素相對(duì)含量影響的雙因子方差分析結(jié)果Tab. 1 Summary of MANOVA on fluorescence parameters, cell density and relative chlorophyll content of D. salina exposed to different heavy metals for different time
2.2 重金屬脅迫對(duì)杜氏鹽藻細(xì)胞密度的影響
重金屬離子(Cu2+、Zn2+、Cd2+)濃度及脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻細(xì)胞密度的影響見圖1～3和表1。雙因子方差分析結(jié)果表明, 重金屬離子濃度、脅迫時(shí)間及二者的交互作用, 對(duì)鹽藻的細(xì)胞密度均有顯著影響(P＜0.05), 其中 3種重金屬離子濃度的影響均最顯著。表 2給出了杜氏鹽藻的細(xì)胞密度與重金屬離子濃度之間的相關(guān)關(guān)系, 由表 2可以看出, 在 Cu2+、Zn2+、Cd2+脅迫下(24～96 h), 鹽藻的細(xì)胞密度與3種重金屬離子濃度均呈顯著的負(fù)相關(guān), 隨著濃度的增大, 細(xì)胞密度逐漸下降。脅迫時(shí)間對(duì)其細(xì)胞密度也有顯著影響(P＜0.05), 與對(duì)照組相比, 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 細(xì)胞密度下降的幅度逐步增大(表4), 在Cu2+、Zn2+、Cd2+的最大濃度下脅迫96 h后, 藻細(xì)胞密度分別下降為對(duì)照組的2.60%, 2.75%, 1.98%。
2.3 重金屬脅迫對(duì)杜氏鹽藻葉綠素含量的影響
重金屬離子(Cu2+、Zn2+、Cd2+)濃度及脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻葉綠素相對(duì)含量的影響見圖1～3和表1。雙因子方差分析結(jié)果表明, 重金屬離子濃度、脅迫時(shí)間及二者的交互作用, 對(duì)鹽藻的葉綠素相對(duì)含量均有顯著影響(P＜0.05), 其中3種重金屬離子濃度的影響均最顯著。表 2給出了杜氏鹽藻的葉綠素相對(duì)含量與重金屬離子濃度之間的相關(guān)關(guān)系, 由表 2可以看出, 在 Cu2+、Zn2+、Cd2+脅迫下(24～96 h), 鹽藻的葉綠素相對(duì)含量與 3種重金屬離子濃度均呈顯著的負(fù)相關(guān), 隨著濃度的增大, 上述參數(shù)逐漸下降。脅迫時(shí)間對(duì)鹽藻的葉綠素相對(duì)含量也有顯著影響(P＜0.05), 與對(duì)照組相比, 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 葉綠素相對(duì)含量下降的幅度逐步增大(表4), 在Cu2+、Zn2+、Cd2+的最大濃度下脅迫96 h后, 葉綠素相對(duì)含量分別下降為對(duì)照組的0.11%, 1.21%, 0.52%。
圖1 Cu2+脅迫對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度和葉綠素相對(duì)含量的影響Fig. 1 Effects of Cu2+ on fluorescence parameters, cell density and relative chlorophyll content of D. salina
2.4 EC50
表4給出了3種重金屬離子脅迫下杜氏鹽藻各葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、葉綠素含量)的 EC50變化情況。由表 5可以看出, 重金屬離子(Cu2+、Zn2+、Cd2+)對(duì)杜氏鹽藻的EC50值與重金屬種類有關(guān)。Cu2+顯示出最低的 EC50值(23.616～506.991μmol/L), 這表明 Cu是對(duì)杜氏鹽藻毒性最大的重金屬離子。Zn2+脅迫下的EC50值最高(315.864～990.376μmol/L), 這表明 Zn2+的毒性最低。Cd2+的毒性介于二者之間(EC50為 24.595～918.333 μmol/L)。因此, 3種重金屬對(duì)杜氏鹽藻毒性的大小順序?yàn)镃u2+＞Cd2+＞Zn2+。
圖2 Zn2+脅迫對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度和葉綠素相對(duì)含量的影響Fig. 2 Effects of Zn2+ on fluorescence parameters, cell density and relative chlorophyll content of D. salina
3 討論
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在不同濃度的 3種重金屬離子(Cu2+、Zn2+、Cd2+)脅迫下, 杜氏鹽藻各葉綠素?zé)晒鈪?shù)均有不同程度的下降, 細(xì)胞密度和葉綠素相對(duì)含量也顯著降低。Cu和 Zn是微藻必需的微量元素之一, 它對(duì)維持生命體的生長(zhǎng)、代謝和酶活性等起著非常重要的作用。本試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn), 在200μmol/L Zn2+(24～72 h)脅迫下, 藻細(xì)胞密度分別為對(duì)照組的110.80%, 118.15%, 104.40%。但高濃度的Cu和 Zn會(huì)使微藻的生長(zhǎng)受到抑制。Cu可影響質(zhì)膜的透性, 導(dǎo)致細(xì)胞丟失 K+, 使細(xì)胞體積發(fā)生變化, 抑制細(xì)胞分裂速度, 干擾葉綠體內(nèi)的光合作用以及ATP的合成, 最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21,22]。Zn不僅抑制相對(duì)光合電子傳遞效率而且使線粒體膜的功能性降低, 葉綠素含量下降, 最終影響藻類的生長(zhǎng)[23]。Cd是一種有毒元素, 可抑制微藻 PSII的活性、CO2同化和Calvin循環(huán)的酶活性, 使類囊體和葉綠素a/b蛋白復(fù)合體天線系統(tǒng)解體[24], 從而使各熒光參數(shù)均有下降趨勢(shì)。通過查找大量文獻(xiàn)以及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出[11,12,23,25,26],Fv/Fm作為反映微藻生長(zhǎng)的指標(biāo), 具有更高靈敏度和特異性。
圖3 Cd2+脅迫對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度和葉綠素相對(duì)含量的影響Fig. 3 Effects of Cd2+ on fluorescence parameters, cell density and relative chlorophyll content of D. salina
通過本實(shí)驗(yàn)可以看出, 重金屬(Cu2+、Zn2+、Cd2+)對(duì)杜氏鹽藻各葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、葉綠素含量)的 EC50值與重金屬種類有關(guān), 對(duì)杜氏鹽藻毒性的大小順序?yàn)?Cu2+＞Cd2+＞Zn2+, 這與文獻(xiàn)[7,8,25～28]報(bào)道一致。但與有些研究結(jié)果有所差異,例如, Prange[29]的研究結(jié)果表明 Zn2+＞Cu2+。Satoh[30]報(bào)道 Cu2+和 Cd2+對(duì) 9種微藻的毒性大小沒有顯著差異。李彬等[31]對(duì)斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)進(jìn)行了研究, EC50順序?yàn)?Cu2+＞Zn2+＞Cd2+。這種差異可能是由于微藻的不同品系、計(jì)算 EC50所用參數(shù)(本實(shí)驗(yàn)及國(guó)外大多數(shù)學(xué)者是用葉綠素?zé)晒鈪?shù)計(jì)算EC50值, 國(guó)內(nèi)學(xué)者多用細(xì)胞密度計(jì)算EC50值)、實(shí)驗(yàn)條件(溫度、光照、營(yíng)養(yǎng)鹽、生長(zhǎng)時(shí)期)等不同引起的。
表2 杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度及葉綠素相對(duì)含量與Cu2+、Zn2+、Cd2+濃度的相關(guān)系數(shù)Tab. 2 The correlation coefficient of chlorophyll fluorescence parameters, cell density and relative chlorophyll content of D. salina with concentrations of Cu2+, Zn2+ and Cd2+
利用葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)可以在對(duì)微藻細(xì)胞無(wú)損傷的情況下快速、靈敏地探測(cè)重金屬脅迫對(duì)微藻的作用并分析其作用機(jī)制[32,33]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看, 杜氏鹽藻的熒光參數(shù)Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、rETR對(duì)重金屬脅迫比較敏感, 上述熒光參數(shù)與重金屬(Cu2+、Zn2+、Cd2+)濃度均呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系, 隨著重金屬濃度的增加而降低, 因此可以利用上述熒光參數(shù)的變化來(lái)反映杜氏鹽藻受重金屬脅迫的情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明, 杜氏鹽藻的熒光參數(shù)(Fv/Fm、Fv/Fo、Yield和 rETR)以及葉綠素相對(duì)含量均與細(xì)胞密度呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。因此, 可以通過測(cè)定逆境下微藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化, 來(lái)評(píng)價(jià)不同微藻品種對(duì)重金屬離子等逆境的適應(yīng)性, 并可作為篩選抗重金屬污染微藻品種的參考指標(biāo), 能否直接用作抗重金屬污染等的鑒定指標(biāo), 還需要針對(duì)不同的微藻品種進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)研究, 以確定該法的可靠性和適應(yīng)性。
表3 杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)及葉綠素相對(duì)含量與細(xì)胞密度的相關(guān)系數(shù)Tab. 3 The correlation coefficient of chlorophyll fluorescence parameters and relative chlorophyll content of D. salina with cell density
表4 不同濃度Cu2+、Zn 2+、Cd2+處理24, 48, 72, 96 h后, 杜氏鹽藻的細(xì)胞密度和葉綠素相對(duì)含量相對(duì)于對(duì)照組的比例Tab. 4 Cell density and chlorophyll content of D. salina (% control) after 24, 48, 72 and 96 h of Cu2+, Zn2+ and Cd2+treatment
表5 不同濃度Cu2+、Zn 2+、Cd2+處理24, 48, 72, 96 h后杜氏鹽藻各葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、葉綠素相對(duì)含量)的 EC50 (μmol/L)Tab. 5 EC50 (μmol/L) for the chlorophyll fluorescence parameters (Fv/Fm, Fv/Fo, Yield and relative chlorophyll content)of D. salina after 24, 48, 72 and 96 h of Cu2+, Zn2+ and Cd2+ treatments
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Effects of heavy metal exposure on the growth and chlorophyll fluorescence of Dunaliella salina
WANG Shuai1,2, LIANG Ying1, FENG Li-xia1, TIAN Chuan-yuan1
(1. The Key Laboratory of Mariculture of Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003,China; 2. The Key Laboratory of Marine Bioactive Substances, The First Institute of Oceanography,SOA, Qingdao 266061,China)
Dec., 10, 2008
Dunaliella salina ;heavy metal stress; chlorophyll fluorescence
The modulate chlorophyll fluorescence kinetics of Dunaliella salina under different concentrations of heavy metals (Cu2+, Zn2+, Cd2+) and different durations (24, 48, 72 and 96 h) were investigated. The main parameters determined in the present study included the maximal photochemical efficiency of PSII (Fv/Fm), the potential activity of PSII(Fv/Fo), the actual photochemical efficiency of PSII in the light (Yield), the relative electron transport rate (rETR), the photochemical quenching (qP), and the non-photochemical quenching (NPQ). The results showed that the parameters of D. salina Fv/Fm, Fv/Fo, Yield, rETR and qP reduced markedly at 600～800 μmol/L by Cu2+, NPQ first decreased then increased, and declined at 400 μmol/L again. The changed degree of the parameters all reduced with the increasing exposure time except qP rose at 96 h; Fv/Fm, Fv/Fo, Yield and rETR reduced under toxic effect by Zn2+, NPQ first decreased then increased, qP declined clearly just at 800～3200 μmol/L by Zn2+, the parameters all decreased with the increasing exposure time; all of the parameters reduced under toxic effect by Cd2+, Fv/Fm, Fv/Foand NPQ first decreased then increased with the increasing exposure time, the data reach to the lowest at 48 h, Yield, rETR and qP decreased all the time.The cell density and chlorophyll content were also decreased under heavy metal stress. The EC50values indicated that the toxicities followed the order of Cu2+＞Cd2+＞Zn2+.
Q945.78
A
1000-3096(2010)10-0038-11
2008-12-10;
2009-03-12
“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD09A03); 中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(200603)
王帥(1983-), 女, 山東濟(jì)南人, 實(shí)習(xí)研究員, 主要從事微藻生理研究, E-mail： wangshuai@fio.org.cn, 電話： 13854206061; 通信作者, 梁英, E-mail： yliang@ouc.edu.cn
(本文編輯： 張培新)
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王 帥, 梁 英, 馮力霞, 田傳遠(yuǎn)
(1. 中國(guó)海洋大學(xué) 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003; 2. 國(guó)家海洋局第一海洋研究所 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266061)
重金屬脅迫對(duì)杜氏鹽藻生長(zhǎng)及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?/p>
王 帥1,2, 梁 英1, 馮力霞1, 田傳遠(yuǎn)1
(1. 中國(guó)海洋大學(xué) 海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003; 2. 國(guó)家海洋局第一海洋研究所 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266061)
研究了杜氏鹽藻Dunaliella salina在不同濃度的Cu2+、Zn2+、Cd2+等重金屬離子脅迫一段時(shí)間(24、48、72 和96 h)后, 葉綠素?zé)晒馓匦缘淖兓闆r。測(cè)定的主要參數(shù)有： PSII的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、PSII的潛在活性(Fv/Fo)、PSII的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Yield)、相對(duì)光合電子傳遞效率(rETR)、光化學(xué)淬滅(qP)和非光化學(xué)淬滅(NPQ)。研究結(jié)果表明, 當(dāng) Cu2+濃度范圍在 600～800 μmol/L時(shí), 杜氏鹽藻的Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、rETR和qP均明顯降低, NPQ變化不規(guī)律, 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 除qP在96 h時(shí)有所上升外, 各熒光參數(shù)均逐漸降低; Zn2+脅迫下Fv/Fm、Fv/Fo、Yield和rETR隨著濃度的增加而降低, NPQ先下降后上升, qP僅在Zn2+濃度范圍(800～3200 μmol/L)下明顯下降, 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 各熒光參數(shù)均逐漸降低; Cd2+脅迫下各熒光參數(shù)均明顯下降, 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), Fv/Fm、Fv/Fo和NPQ先下降后上升, 在48 h時(shí)達(dá)到最低值, Yield、rETR和qP均逐漸降低。在3種重金屬離子脅迫下, 細(xì)胞密度和葉綠素相對(duì)含量也顯著降低。根據(jù) 3種重金屬離子的半抑制濃度(EC50), 其毒性大小順序?yàn)?Cu2+＞Cd2+＞ Zn2+。
杜氏鹽藻Dunaliella salina; 重金屬脅迫; 葉綠素?zé)晒?/p>
微藻作為海洋的主要初級(jí)生產(chǎn)者在研究生態(tài)系統(tǒng)中是一個(gè)重要因素, 其光合作用的強(qiáng)弱決定了在食物鏈中可以傳遞的能量的多少。隨著海洋污染的日益嚴(yán)重, Cu2+、Zn2+、Cd2+等重金屬離子在海水中的濃度不斷增加, 微藻的光合作用過程受重金屬的影響越來(lái)越大[1～6]。因此, 研究重金屬離子對(duì)海洋微藻的毒害作用, 并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行水污染生物監(jiān)測(cè)具有十分重要的意義。
以往研究重金屬對(duì)微藻毒性的方法是將微藻置于含有不同濃度重金屬離子的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng),通過測(cè)定微藻細(xì)胞密度、葉綠素含量等指標(biāo)來(lái)反映重金屬對(duì)微藻生長(zhǎng)的影響。對(duì)微藻生長(zhǎng)的半抑制濃度(EC50)、半致死濃度(LC50)或刺激濃度(SC20)可以用來(lái)表示微藻對(duì)重金屬脅迫的敏感程度[6～9], 一般測(cè)定其72 h或96 h的EC50或LC50。但該法存在測(cè)量時(shí)間較長(zhǎng)、測(cè)量結(jié)果不是很準(zhǔn)確(微藻的活細(xì)胞和死細(xì)胞較難區(qū)分)等缺陷。因此, 尋找一種快速、簡(jiǎn)便、對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷的方法, 就顯得十分必要和迫切。為了解決這個(gè)問題, 國(guó)外某些學(xué)者嘗試用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)來(lái)測(cè)定重金屬對(duì)微藻的毒害作用[8,10～13], 測(cè)定的主要參數(shù)有 PSII的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、Fv'/Fm'(PSII有效光化學(xué)量子產(chǎn)量)、PSII的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Yield)、光化學(xué)淬滅(qP)、非光化學(xué)淬滅(NPQ)等, 并以某些熒光參數(shù)(Fv'/Fm'、Yield、qP等)的半抑制濃度(EC50)來(lái)表示微藻受重金屬脅迫的程度[14,15]。這種方法具有快速、準(zhǔn)確、需要樣品量少的優(yōu)點(diǎn)。但目前應(yīng)用此法開展的研究工作還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠, 還未見用葉綠素?zé)晒夥ㄑ芯恐亟饘匐x子對(duì)杜氏鹽藻影響的報(bào)道。
鹽藻具有很強(qiáng)的耐鹽性, 可以在含0.05～5.5 mol/L NaCl的培養(yǎng)液中生存[16], 是迄今為止最耐鹽的真核生物。其細(xì)胞內(nèi) β-胡蘿卜素、甘油和蛋白質(zhì)含量十分豐富, 含有包括人類必需氨基酸在內(nèi)的 18種氨基酸, 因此具有非常重要的商業(yè)價(jià)值。杜氏鹽藻的抗逆性很強(qiáng),近年來(lái)已被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于環(huán)境脅迫的研究[17], 作者研究了重金屬脅迫對(duì)杜氏鹽藻生長(zhǎng)及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊? 并據(jù)此計(jì)算出葉綠素?zé)晒鈪?shù)的半抑制濃度(EC50), 以期對(duì)將來(lái)培育抗逆性強(qiáng)的微藻品種及水污染生物監(jiān)測(cè)提供參考依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 藻種
實(shí)驗(yàn)所用杜氏鹽藻 Dunaliella salina (MACC/C43)藻種取自中國(guó)海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫(kù)。
1.2 微藻培養(yǎng)及重金屬脅迫
預(yù)培養(yǎng)在3 000 mL的三角燒瓶中進(jìn)行, 采用f/2培養(yǎng)基[18], 鹽度為28, 培養(yǎng)溫度為25℃±1, pH℃為8.2, 連續(xù)光照, 光強(qiáng)強(qiáng)度為4 000 lx。
實(shí)驗(yàn)在250 mL的三角燒瓶中進(jìn)行, 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果, 將 Cu2+濃度設(shè)定為 0, 100, 200, 400, 600,800 μmol/L等梯度; Zn2+濃度設(shè)定為0, 200, 400, 600,800, 1600, 3 200 μmol/L等梯度; Cd2+濃度設(shè)定為0,50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000 μmol/L 等梯度。以不加重金屬的空白組為對(duì)照, 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的杜氏鹽藻以相同的接種量(9×104個(gè)/mL)分別接入上述重金屬離子濃度的培養(yǎng)液中進(jìn)行重金屬脅迫處理;每個(gè)濃度3個(gè)平行組。培養(yǎng)過程中不充氣, 每日隨機(jī)調(diào)換三角燒瓶并搖動(dòng)3～5次。分別于脅迫24, 48, 72,96 h后取樣, 進(jìn)行細(xì)胞密度(血球計(jì)數(shù)板)、葉綠素含量及葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)參數(shù)的測(cè)定。
1.3 葉綠素含量的測(cè)定
用德國(guó)Walz公司產(chǎn)Water-PAM水樣葉綠素?zé)晒鈨x(Walz, Effeltrich, Germany)進(jìn)行葉綠素含量的測(cè)定,由于瞬間熒光產(chǎn)量(F)和葉綠素濃度在一定范圍內(nèi)成正比, 通過校正可測(cè)出葉綠素含量。為避免校正過程中可能產(chǎn)生的誤差, 文中的葉綠素含量用相對(duì)含量(每次測(cè)得的葉綠素含量與接種時(shí)葉綠素含量的比值)表示。
1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定
用德國(guó)Walz公司產(chǎn)Water-PAM水樣葉綠素?zé)晒鈨x(Walz, Effeltrich, Germany)進(jìn)行葉綠素?zé)晒飧鱾€(gè)參數(shù)的測(cè)定。測(cè)量前將微藻樣品暗適應(yīng) 15 min。葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、Yield、rETR、qP和NPQ可在熒光儀上直接讀出, Fv/Fo則用公式(Fm-Fo)/ Fo計(jì)算出,其中 Fo(基礎(chǔ)熒光)用弱測(cè)量光(0.5 lx)測(cè)量可得, 用飽和脈沖(200 000 lx, 持續(xù)時(shí)間為 0.8 s)激發(fā)可得Fm(最大熒光)。
1.5 EC50的測(cè)定
EC50是指半抑制濃度, 利用機(jī)率單位法[19,20]計(jì)算得出。
1.6 統(tǒng)計(jì)分析
利用SPSS11.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
2 結(jié)果
2.1 重金屬脅迫對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒飧鲄?shù)的影響
Cu2+濃度及脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響見圖1和表1。雙因子方差分析結(jié)果(表1)表明, Cu2+濃度、脅迫時(shí)間及二者的交互作用(Cu2+濃度×?xí)r間)對(duì)杜氏鹽藻各熒光參數(shù)均有顯著影響(P＜0.05), 其中 Cu2+濃度的影響最顯著。熒光參數(shù)Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、rETR、qP與 Cu2+濃度均呈顯著的負(fù)相關(guān)(表 2), 當(dāng) Cu2+濃度范圍在 600～800μmol/L, 以上各熒光參數(shù)值明顯降低。脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻各熒光參數(shù)均有顯著性影響(P＜0.05), 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 當(dāng) Cu2+濃度范圍在 600～800 μmol/L時(shí), Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、rETR 和 NPQ 均逐漸降低, 僅qP在96 h時(shí)有所上升。
Zn2+濃度及脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響見圖2和表1。雙因子方差分析結(jié)果(表1)表明, Zn2+濃度、脅迫時(shí)間及二者的交互作用(Zn2+濃度×?xí)r間)對(duì)杜氏鹽藻各熒光參數(shù)均有顯著影響(P＜0.05), 其中 Zn2+濃度的影響最顯著。熒光參數(shù)Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、rETR、qP與 Zn2+濃度均呈顯著的負(fù)相關(guān)(表 2), 當(dāng) Zn2+濃度范圍在 800～3200μmol/L時(shí), qP明顯下降, 其余各熒光參數(shù)值均隨著Zn2+濃度的增加而降低。NPQ則與 Zn2+濃度呈顯著的正相關(guān)。脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻各熒光參數(shù)均有顯著影響(P＜0.05), 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 各熒光參數(shù)均逐漸降低。
Cd2+濃度及脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響見圖3和表1。雙因子方差分析結(jié)果(表1)表明, Cd2+濃度、脅迫時(shí)間及二者的交互作用(Cd2+濃度×?xí)r間)對(duì)杜氏鹽藻各熒光參數(shù)均有顯著影響(P＜0.05), 其中 Cd2+濃度的影響最顯著。熒光參數(shù)Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、rETR與 Cd2+濃度均呈顯著的負(fù)相關(guān)(表2), 以上各熒光參數(shù)值均隨著Cd2+濃度的增加而降低。脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻各熒光參數(shù)也有顯著影響(P＜0.05), 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), Fv/Fm、Fv/Fo和NPQ先下降后上升, 在48 h時(shí)達(dá)到最低值,Yield、rETR和qP均逐漸降低。
表 3給出了杜氏鹽藻的熒光參數(shù)以及葉綠素相對(duì)含量與細(xì)胞密度之間的相關(guān)關(guān)系。由表 3可以看出, 在 Cu2+、Zn2+、Cd2+脅迫下(24～96 h), 鹽藻的熒光參數(shù)(Fv/Fm、Fv/Fo、Yield和 rETR)與細(xì)胞密度均呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。特別是鹽藻的葉綠素相對(duì)含量與細(xì)胞密度呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系, 而且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 相關(guān)系數(shù)逐步增大。說明重金屬脅迫下藻細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制也能夠從部分熒光參數(shù)中得到反映。因此可以利用上述參數(shù)的變化來(lái)反映鹽藻的生長(zhǎng)情況及其對(duì)重金屬脅迫的適應(yīng)性。但鹽藻的熒光參數(shù)qP、NPQ與細(xì)胞密度的相關(guān)性不顯著。
表1 重金屬濃度和脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻熒光參數(shù)、細(xì)胞密度及葉綠素相對(duì)含量影響的雙因子方差分析結(jié)果Tab. 1 Summary of MANOVA on fluorescence parameters, cell density and relative chlorophyll content of D. salina exposed to different heavy metals for different time
2.2 重金屬脅迫對(duì)杜氏鹽藻細(xì)胞密度的影響
重金屬離子(Cu2+、Zn2+、Cd2+)濃度及脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻細(xì)胞密度的影響見圖1～3和表1。雙因子方差分析結(jié)果表明, 重金屬離子濃度、脅迫時(shí)間及二者的交互作用, 對(duì)鹽藻的細(xì)胞密度均有顯著影響(P＜0.05), 其中 3種重金屬離子濃度的影響均最顯著。表 2給出了杜氏鹽藻的細(xì)胞密度與重金屬離子濃度之間的相關(guān)關(guān)系, 由表 2可以看出, 在 Cu2+、Zn2+、Cd2+脅迫下(24～96 h), 鹽藻的細(xì)胞密度與3種重金屬離子濃度均呈顯著的負(fù)相關(guān), 隨著濃度的增大, 細(xì)胞密度逐漸下降。脅迫時(shí)間對(duì)其細(xì)胞密度也有顯著影響(P＜0.05), 與對(duì)照組相比, 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 細(xì)胞密度下降的幅度逐步增大(表4), 在Cu2+、Zn2+、Cd2+的最大濃度下脅迫96 h后, 藻細(xì)胞密度分別下降為對(duì)照組的2.60%, 2.75%, 1.98%。
2.3 重金屬脅迫對(duì)杜氏鹽藻葉綠素含量的影響
重金屬離子(Cu2+、Zn2+、Cd2+)濃度及脅迫時(shí)間對(duì)杜氏鹽藻葉綠素相對(duì)含量的影響見圖1～3和表1。雙因子方差分析結(jié)果表明, 重金屬離子濃度、脅迫時(shí)間及二者的交互作用, 對(duì)鹽藻的葉綠素相對(duì)含量均有顯著影響(P＜0.05), 其中3種重金屬離子濃度的影響均最顯著。表 2給出了杜氏鹽藻的葉綠素相對(duì)含量與重金屬離子濃度之間的相關(guān)關(guān)系, 由表 2可以看出, 在 Cu2+、Zn2+、Cd2+脅迫下(24～96 h), 鹽藻的葉綠素相對(duì)含量與 3種重金屬離子濃度均呈顯著的負(fù)相關(guān), 隨著濃度的增大, 上述參數(shù)逐漸下降。脅迫時(shí)間對(duì)鹽藻的葉綠素相對(duì)含量也有顯著影響(P＜0.05), 與對(duì)照組相比, 隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng), 葉綠素相對(duì)含量下降的幅度逐步增大(表4), 在Cu2+、Zn2+、Cd2+的最大濃度下脅迫96 h后, 葉綠素相對(duì)含量分別下降為對(duì)照組的0.11%, 1.21%, 0.52%。
圖1 Cu2+脅迫對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度和葉綠素相對(duì)含量的影響Fig. 1 Effects of Cu2+ on fluorescence parameters, cell density and relative chlorophyll content of D. salina
2.4 EC50
表4給出了3種重金屬離子脅迫下杜氏鹽藻各葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、葉綠素含量)的 EC50變化情況。由表 5可以看出, 重金屬離子(Cu2+、Zn2+、Cd2+)對(duì)杜氏鹽藻的EC50值與重金屬種類有關(guān)。Cu2+顯示出最低的 EC50值(23.616～506.991μmol/L), 這表明 Cu是對(duì)杜氏鹽藻毒性最大的重金屬離子。Zn2+脅迫下的EC50值最高(315.864～990.376μmol/L), 這表明 Zn2+的毒性最低。Cd2+的毒性介于二者之間(EC50為 24.595～918.333 μmol/L)。因此, 3種重金屬對(duì)杜氏鹽藻毒性的大小順序?yàn)镃u2+＞Cd2+＞Zn2+。
圖2 Zn2+脅迫對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度和葉綠素相對(duì)含量的影響Fig. 2 Effects of Zn2+ on fluorescence parameters, cell density and relative chlorophyll content of D. salina
3 討論
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在不同濃度的 3種重金屬離子(Cu2+、Zn2+、Cd2+)脅迫下, 杜氏鹽藻各葉綠素?zé)晒鈪?shù)均有不同程度的下降, 細(xì)胞密度和葉綠素相對(duì)含量也顯著降低。Cu和 Zn是微藻必需的微量元素之一, 它對(duì)維持生命體的生長(zhǎng)、代謝和酶活性等起著非常重要的作用。本試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn), 在200μmol/L Zn2+(24～72 h)脅迫下, 藻細(xì)胞密度分別為對(duì)照組的110.80%, 118.15%, 104.40%。但高濃度的Cu和 Zn會(huì)使微藻的生長(zhǎng)受到抑制。Cu可影響質(zhì)膜的透性, 導(dǎo)致細(xì)胞丟失 K+, 使細(xì)胞體積發(fā)生變化, 抑制細(xì)胞分裂速度, 干擾葉綠體內(nèi)的光合作用以及ATP的合成, 最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21,22]。Zn不僅抑制相對(duì)光合電子傳遞效率而且使線粒體膜的功能性降低, 葉綠素含量下降, 最終影響藻類的生長(zhǎng)[23]。Cd是一種有毒元素, 可抑制微藻 PSII的活性、CO2同化和Calvin循環(huán)的酶活性, 使類囊體和葉綠素a/b蛋白復(fù)合體天線系統(tǒng)解體[24], 從而使各熒光參數(shù)均有下降趨勢(shì)。通過查找大量文獻(xiàn)以及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出[11,12,23,25,26],Fv/Fm作為反映微藻生長(zhǎng)的指標(biāo), 具有更高靈敏度和特異性。
圖3 Cd2+脅迫對(duì)杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度和葉綠素相對(duì)含量的影響Fig. 3 Effects of Cd2+ on fluorescence parameters, cell density and relative chlorophyll content of D. salina
通過本實(shí)驗(yàn)可以看出, 重金屬(Cu2+、Zn2+、Cd2+)對(duì)杜氏鹽藻各葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、葉綠素含量)的 EC50值與重金屬種類有關(guān), 對(duì)杜氏鹽藻毒性的大小順序?yàn)?Cu2+＞Cd2+＞Zn2+, 這與文獻(xiàn)[7,8,25～28]報(bào)道一致。但與有些研究結(jié)果有所差異,例如, Prange[29]的研究結(jié)果表明 Zn2+＞Cu2+。Satoh[30]報(bào)道 Cu2+和 Cd2+對(duì) 9種微藻的毒性大小沒有顯著差異。李彬等[31]對(duì)斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)進(jìn)行了研究, EC50順序?yàn)?Cu2+＞Zn2+＞Cd2+。這種差異可能是由于微藻的不同品系、計(jì)算 EC50所用參數(shù)(本實(shí)驗(yàn)及國(guó)外大多數(shù)學(xué)者是用葉綠素?zé)晒鈪?shù)計(jì)算EC50值, 國(guó)內(nèi)學(xué)者多用細(xì)胞密度計(jì)算EC50值)、實(shí)驗(yàn)條件(溫度、光照、營(yíng)養(yǎng)鹽、生長(zhǎng)時(shí)期)等不同引起的。
表2 杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度及葉綠素相對(duì)含量與Cu2+、Zn2+、Cd2+濃度的相關(guān)系數(shù)Tab. 2 The correlation coefficient of chlorophyll fluorescence parameters, cell density and relative chlorophyll content of D. salina with concentrations of Cu2+, Zn2+ and Cd2+
利用葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)可以在對(duì)微藻細(xì)胞無(wú)損傷的情況下快速、靈敏地探測(cè)重金屬脅迫對(duì)微藻的作用并分析其作用機(jī)制[32,33]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看, 杜氏鹽藻的熒光參數(shù)Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、rETR對(duì)重金屬脅迫比較敏感, 上述熒光參數(shù)與重金屬(Cu2+、Zn2+、Cd2+)濃度均呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系, 隨著重金屬濃度的增加而降低, 因此可以利用上述熒光參數(shù)的變化來(lái)反映杜氏鹽藻受重金屬脅迫的情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明, 杜氏鹽藻的熒光參數(shù)(Fv/Fm、Fv/Fo、Yield和 rETR)以及葉綠素相對(duì)含量均與細(xì)胞密度呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。因此, 可以通過測(cè)定逆境下微藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化, 來(lái)評(píng)價(jià)不同微藻品種對(duì)重金屬離子等逆境的適應(yīng)性, 并可作為篩選抗重金屬污染微藻品種的參考指標(biāo), 能否直接用作抗重金屬污染等的鑒定指標(biāo), 還需要針對(duì)不同的微藻品種進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)研究, 以確定該法的可靠性和適應(yīng)性。
表3 杜氏鹽藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)及葉綠素相對(duì)含量與細(xì)胞密度的相關(guān)系數(shù)Tab. 3 The correlation coefficient of chlorophyll fluorescence parameters and relative chlorophyll content of D. salina with cell density
表4 不同濃度Cu2+、Zn 2+、Cd2+處理24, 48, 72, 96 h后, 杜氏鹽藻的細(xì)胞密度和葉綠素相對(duì)含量相對(duì)于對(duì)照組的比例Tab. 4 Cell density and chlorophyll content of D. salina (% control) after 24, 48, 72 and 96 h of Cu2+, Zn2+ and Cd2+treatment
表5 不同濃度Cu2+、Zn 2+、Cd2+處理24, 48, 72, 96 h后杜氏鹽藻各葉綠素?zé)晒鈪?shù)(Fv/Fm、Fv/Fo、Yield、葉綠素相對(duì)含量)的 EC50 (μmol/L)Tab. 5 EC50 (μmol/L) for the chlorophyll fluorescence parameters (Fv/Fm, Fv/Fo, Yield and relative chlorophyll content)of D. salina after 24, 48, 72 and 96 h of Cu2+, Zn2+ and Cd2+ treatments
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Effects of heavy metal exposure on the growth and chlorophyll fluorescence of Dunaliella salina
WANG Shuai1,2, LIANG Ying1, FENG Li-xia1, TIAN Chuan-yuan1
(1. The Key Laboratory of Mariculture of Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003,China; 2. The Key Laboratory of Marine Bioactive Substances, The First Institute of Oceanography,SOA, Qingdao 266061,China)
Dec., 10, 2008
Dunaliella salina ;heavy metal stress; chlorophyll fluorescence
The modulate chlorophyll fluorescence kinetics of Dunaliella salina under different concentrations of heavy metals (Cu2+, Zn2+, Cd2+) and different durations (24, 48, 72 and 96 h) were investigated. The main parameters determined in the present study included the maximal photochemical efficiency of PSII (Fv/Fm), the potential activity of PSII(Fv/Fo), the actual photochemical efficiency of PSII in the light (Yield), the relative electron transport rate (rETR), the photochemical quenching (qP), and the non-photochemical quenching (NPQ). The results showed that the parameters of D. salina Fv/Fm, Fv/Fo, Yield, rETR and qP reduced markedly at 600～800 μmol/L by Cu2+, NPQ first decreased then increased, and declined at 400 μmol/L again. The changed degree of the parameters all reduced with the increasing exposure time except qP rose at 96 h; Fv/Fm, Fv/Fo, Yield and rETR reduced under toxic effect by Zn2+, NPQ first decreased then increased, qP declined clearly just at 800～3200 μmol/L by Zn2+, the parameters all decreased with the increasing exposure time; all of the parameters reduced under toxic effect by Cd2+, Fv/Fm, Fv/Foand NPQ first decreased then increased with the increasing exposure time, the data reach to the lowest at 48 h, Yield, rETR and qP decreased all the time.The cell density and chlorophyll content were also decreased under heavy metal stress. The EC50values indicated that the toxicities followed the order of Cu2+＞Cd2+＞Zn2+.
Q945.78
A
1000-3096(2010)10-0038-11
2008-12-10;
2009-03-12
“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD09A03); 中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(200603)
王帥(1983-), 女, 山東濟(jì)南人, 實(shí)習(xí)研究員, 主要從事微藻生理研究, E-mail： wangshuai@fio.org.cn, 電話： 13854206061; 通信作者, 梁英, E-mail： yliang@ouc.edu.cn
(本文編輯： 張培新)
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