孫建華，戴榮繼，鄧玉林

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

進(jìn)展與述評

酶固定化技術(shù)研究進(jìn)展

孫建華，戴榮繼，鄧玉林

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京 100081）

酶在工業(yè)化利用之前，必須要經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶幚?，目的是改善酶的性能。酶固定化技術(shù)是改善酶的催化性能最重要、常用的手段。本文介紹了酶固定化技術(shù)的最新研究成果（如多點共價結(jié)合、單酶納米粒、磁性納米纖維、交聯(lián)酶結(jié)晶、交聯(lián)酶聚集體、分子伴侶、人工油體、適配體等），重點描述了通過固定化來改善酶的催化性能，包括酶的穩(wěn)定性、活力、立體選擇性以及回收利用性能等。

酶；固定化；催化性能

近幾年，酶及其固定化酶在化學(xué)工業(yè)中得到了日益廣泛的應(yīng)用[1-5]。但是酶制劑仍然存在諸多的缺陷[6]。首先，酶大都具有親水性，而在大多數(shù)有機(jī)反應(yīng)中，底物和產(chǎn)物是疏水性的，水的存在會破壞反應(yīng)的熱力學(xué)平衡，甚至使反應(yīng)難以進(jìn)行；其次是酶活性對外界環(huán)境高度敏感，高溫、高壓、酸堿、反應(yīng)物和產(chǎn)物濃度的變化都會對酶的活力產(chǎn)生抑制作用；第三是酶的回收利用問題，酶制劑價格昂貴，造成了生產(chǎn)成本的提高。如何解決上述問題，成為酶能否在現(xiàn)代工業(yè)中應(yīng)用的關(guān)鍵所在。涉及很多學(xué)科的新技術(shù)可以用于改善酶的性能，如定向進(jìn)化技術(shù)[7]、游離酶的化學(xué)改性[8]等。固定化技術(shù)是最常用的改善酶性能的工具，可以大大改善酶的穩(wěn)定性、催化活性、選擇性和抗抑制性；此外，固定化酶的另一個優(yōu)點在于它的固體形態(tài)，這個特征使人們能夠設(shè)計靈活多樣的固定方法[9]。本文簡單概括了固定化技術(shù)的最新研究成果，見表 1。重點描述酶固定化可以解決的一些問題，如提高酶的穩(wěn)定性、酶活力、選擇性、抗抑制性及酶的回收利用性能等。

1 提高酶穩(wěn)定性

在工業(yè)生產(chǎn)、儲存和應(yīng)用過程中，酶的三級結(jié)構(gòu)會被破壞，使主要的氨基酸殘基不能緊密排列，從而喪失催化活性[10]，因此需要在工業(yè)化利用之前對酶進(jìn)行穩(wěn)定化，通過固定化技術(shù)來改善酶的穩(wěn)定性是最常用的手段[11]。

表1 固定化酶的研究進(jìn)展

1.1 多點共價結(jié)合固定化

多點共價結(jié)合是一種十分有效的提高酶的熱力學(xué)穩(wěn)定性的方法[12]。簡單的單點共價作用只能把酶固定于載體表面，并不足以使酶形成剛性結(jié)構(gòu)，而多點共價結(jié)合通過多個均勻排列的短臂使蛋白上殘基的相對距離保持不變，使酶形成了剛性結(jié)構(gòu)，大大提高了酶的穩(wěn)定性。例如，通過氨基和醛基瓊脂糖的多點共價連接，可以將從嗜熱脂肪芽胞桿菌中分離的酯酶的穩(wěn)定性比單點結(jié)合的穩(wěn)定性提高60倍，而比游離酶的穩(wěn)定性提高了30 000倍，還可以保持游離酶70%的活力[13]。

酶和載體材料往往具有完全不同的幾何形狀，如何將兩個不同剛性的結(jié)構(gòu)連接在一起，不是輕而易舉就能辦到的，而且，新的化學(xué)鍵的形成也可能會破壞酶的剛性結(jié)構(gòu)，使酶鈍化或失活，因此必須嚴(yán)格考慮固定化條件的影響，包括載體的種類、反應(yīng)時間、pH值、緩沖溶液、反應(yīng)溫度以及添加劑[14]。有的情況下，還需要對酶或者載體進(jìn)行化學(xué)修飾（圖1），然后進(jìn)行固定化[15]。為了最大程度保持游離酶的活性，固定化過程也可以分步進(jìn)行，如采用含有醛基的載體Sepabeads-EP來固定青霉素?；笗r，首先進(jìn)行共價固定，再用氨基酸對載體上的殘余醛基進(jìn)行封閉，這樣得到的固定化酶比游離酶的穩(wěn)定性提高了10000倍[16]。多亞基酶的各個亞單元很難在同一表面上，在這種情況下，可以在共價結(jié)合之后，再用功能聚合物進(jìn)行交聯(lián)，利用該方法將從Rhodotorula gracilis中得到的D-氨基酸氧化酶進(jìn)行固定化后，穩(wěn)定性提高了 7000倍[17]；再如將牛肝過氧化氫酶[18]的不穩(wěn)定四聚體通過共價鍵固定于高度激活的醛基瓊脂糖凝膠，再用葡聚糖醛（部分氧化的葡聚糖）進(jìn)行交聯(lián)，可以得到很好的穩(wěn)定化效果。

圖1 酶的多點共價鍵結(jié)合固定化

1.2 設(shè)計酶的微環(huán)境

大多數(shù)酶的活性在親水的微環(huán)境下才能保持穩(wěn)定。通過在載體上引入親水基團(tuán)很容易創(chuàng)造親水微環(huán)境。例如，使用環(huán)氧樹脂Eupergit C固定青霉素?；笗r，用牛血清蛋白對多余的環(huán)氧基進(jìn)行淬滅，并在酶的周圍營造了親水性的微環(huán)境，使固定化酶在連續(xù)使用50次循環(huán)以后仍然未見活力損失[19]，使用小分子試劑如L-賴氨酸、乙醇胺等對載體上剩余醛基或環(huán)氧基進(jìn)行淬滅，也可以使固定化酶更加穩(wěn)定[20]。另外，也可以在酶和載體之間引入親水型的長鏈來創(chuàng)造親水環(huán)境，如將聚乙烯胺與多孔瓊脂糖表面的醛基發(fā)生反應(yīng)，然后將蛋白吸附于聚乙烯胺長鏈中，從而引入了一個適宜酶活性構(gòu)象的微環(huán)境，用這種方法固定化可以使環(huán)己酮單加氧酶[21]、嗜熱脂肪芽孢桿菌脂肪酶[22]更加穩(wěn)定。最近，人們使用半透膜將酶進(jìn)行膠囊化，一方面可以保證酶不受外界機(jī)械力的影響，另一方面可以提供酶適宜的親水微環(huán)境，從而提高了酶的穩(wěn)定性。

1.3 新材料、新技術(shù)的使用

最常用的固定化方式是表面吸附，但吸附固定的最大缺點是酶的泄露帶來的活力降低。介孔材料應(yīng)用于酶的固定化可以有效解決這個問題，在一個小直徑的孔中固載了高濃度的酶（圖 2），就會阻礙酶的折疊展開或變性[23]。例如，核糖核酸酶 A在中孔氧化硅材料中的固定化可以大大改善其穩(wěn)定性[24]，酶分子在外界機(jī)械力的作用下，體積未見明顯變化，這說明酶的結(jié)構(gòu)是保持穩(wěn)定的。

圖2 介孔材料中酶的固定化

影響介孔材料中酶的穩(wěn)定性的因素很多，包括孔徑、孔體積[25]、酶和介孔材料的表面電荷形態(tài)[26]等。大孔徑的材料經(jīng)常會造成酶的泄露而影響其長期使用的穩(wěn)定性，孔徑太小又可能造成酶分子無法進(jìn)入材料；如果酶與材料的表面電荷相反，靜電吸附力會提高酶的穩(wěn)定性，而酶與材料表面的電荷相同，靜電斥力就會造成酶的泄露。Ma等[27]將裝載了酶的中孔硅載體用乙烯基三甲氧基硅烷進(jìn)行封閉也可以有效降低酶的泄露；Coradin等[28]則是將中孔氧化硅中注入海藻酸溶液，將 β-galactosidase固定于海藻酸-氧化硅材料中，再用Ca2+誘導(dǎo)凝膠化。多孔材料的制備也可以通過加入致孔劑，然后凝膠化，再去除致孔劑形成多孔凝膠，凝膠的結(jié)構(gòu)限制了酶構(gòu)象的改變，避免了酶的泄露，增加了酶的穩(wěn)定性[29]。

多種學(xué)科的研究成果經(jīng)常被應(yīng)用于固定化技術(shù)，可以十分有效地對酶進(jìn)行固定化，并能夠大大改善酶的穩(wěn)定性。其中報道較多的技術(shù)是納米技術(shù)和生物技術(shù)。例如，帶靜電的納米纖維纏結(jié)能夠形成多孔結(jié)構(gòu)，可以提高酶的穩(wěn)定性，其半衰期比自由酶提高了18倍[30]。最近，Kim等[31]報道了該課題小組的單酶納米粒（SENs）（圖3），即將單個酶分子包埋于幾納米厚的多孔有機(jī)/無機(jī)網(wǎng)絡(luò)中，研究發(fā)現(xiàn)酶的穩(wěn)定性大大提高，并且沒有傳質(zhì)阻力。生物新技術(shù)的應(yīng)用也能夠使固定化酶穩(wěn)定性大大提高，有作者[32]報道了使用極端嗜熱分子伴侶與酶進(jìn)行共固定，可以極大提高酶的熱力學(xué)穩(wěn)定性。分子伴侶是體外影響蛋白質(zhì)折疊的一組蛋白的總稱，超嗜熱型分子伴侶T.KS-1 cpn發(fā)現(xiàn)于真核生物的細(xì)胞質(zhì)中，由兩個堆疊的對稱環(huán)形結(jié)構(gòu)組成。

圖3 單酶納米粒的制備

2 提高酶的活力

固定化酶的活力往往比游離酶的活力低，而且載體占了固定化酶的絕大部分，因此不僅降低了固定化酶的催化能力，而且對工業(yè)反應(yīng)器的體積設(shè)計提出了要求。因此，固定化過程需要盡量保持并改善酶的活力，增加單位體積載體的酶裝載量。解決的辦法包括誘導(dǎo)酶呈現(xiàn)活性構(gòu)象、增加載體的裝載能力和無載體固定化酶等技術(shù)。

2.1 誘導(dǎo)酶呈現(xiàn)活性構(gòu)象

誘導(dǎo)酶呈現(xiàn)活性構(gòu)象是建立在對酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制充分了解的基礎(chǔ)上，因此人們往往選擇青霉素?；?、酯酶等作為目標(biāo)酶。如酯酶在水溶液的狀態(tài)下，其活性口袋處于封閉的狀態(tài)，將酯酶固定于疏水表面，就會使酯酶的活性中心處完全開放的狀態(tài)，從而保證了酯酶的構(gòu)象始終處于有活性狀態(tài)[33]；再如青霉素?；竅34]，用?；梢哉T導(dǎo)其絲氨酸活性位點完全暴露。表面活性劑的存在也會對酶的構(gòu)象產(chǎn)生一定的誘導(dǎo)作用，大的表面活性劑分子與酶的活性中心產(chǎn)生了靜電結(jié)合，使酶的活性口袋始終處于開放的狀態(tài)（圖 4），F(xiàn)ernandez等[35]將酯酶在表面活性劑存在的條件下，進(jìn)行表面交聯(lián)，可以得到具有足夠剛性的酶結(jié)構(gòu)，有效阻止了酶的封閉構(gòu)象的產(chǎn)生。此外，有人利用生物素和親和素特定的親和作用來固定酶，制備的生物催化膜的活力是隨機(jī)固定法的20倍[36]。

圖4 表面活性劑存在的條件下酶活性中心的開放構(gòu)象

2.2 增加載體的載酶能力

對于使用多孔材料進(jìn)行吸附或共價結(jié)合的載體而言，載體的孔徑和比表面積決定了單位質(zhì)量的固定化酶的催化能力[37]。在載體上接枝疏水或者親水的間臂，還可以提供酶適宜的微環(huán)境，使酶的構(gòu)象更加靈活，活力得到改善的同時，酶的固載量也有一定提高[38]。目前研究較多的是用凝膠包埋或膠囊化的手段對酶固定化，不僅可以降低體系中的有機(jī)溶劑、底物和產(chǎn)物對酶的抑制作用，也可以提高單位體積固定化酶的載酶量。Barnab等[39]將乙酰膽堿酶包埋于脂質(zhì)體中，包埋率可以提高到40%，并且通過重組膜孔蛋白來控制脂質(zhì)體的滲透性，很好地保持了酶的活力。Ariel等[40]將枯草桿菌蛋白酶顆粒包埋于海藻酸微球中，固載量可高達(dá)76%，同時，酶的活力也保持了游離酶的93%。

2.3 無載體固定化

無載體固定化酶技術(shù)是通過將結(jié)晶酶、物理共沉淀的酶進(jìn)行交聯(lián)形成固定化酶，包括交聯(lián)酶結(jié)晶（CLEC）、交聯(lián)酶聚集體（CLEA）（圖5）。CLEC早在 1964年就有報道[41]，但由于制備酶結(jié)晶的過程比較復(fù)雜，因此沒有引起人們的足夠重視。研究發(fā)現(xiàn)[42-44]，CLEC具有良好的熱力學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械穩(wěn)定性，在廣泛的pH值范圍內(nèi)和有機(jī)溶劑中都可以保持活力，殘余活力的控制可以通過改變結(jié)晶條件來實現(xiàn)，將一些蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶[45]用這種方法固定，還可以有效防止蛋白的自身分解。制備CLEC的前提是需要純的酶結(jié)晶，然而結(jié)晶的過程往往十分復(fù)雜，為了避免這一過程，人們在研究中發(fā)現(xiàn)，改變粗酶液中的化學(xué)環(huán)境，使酶沉淀、交聯(lián)形成CLEA，也可以得到與CLEC相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性和活力[46]。在催化功能方面，CLEC和 CLEA的單位體積活力是傳統(tǒng)的載體固定化酶10～1000倍[47]，這非常有利于提高酶制劑的時空產(chǎn)率。無載體固定化酶的研究方向就是將更多的酶進(jìn)行固定、尋找控制顆粒直徑大小的方法、新的沉淀方法、新的交聯(lián)劑以及對交聯(lián)酶結(jié)晶的活性位點進(jìn)一步化學(xué)修飾等[48]，使這種固定化方式發(fā)展成為一項通用技術(shù)。

圖5 交聯(lián)酶結(jié)晶(CLEC)和交聯(lián)酶聚集體（CLEA）

3 改善酶的立體選擇性

不對稱合成是現(xiàn)代有機(jī)合成的發(fā)展方向，而酶幾乎可以催化所有類型的不對稱反應(yīng)，并且可以催化許多金屬催化劑無法完成的反應(yīng)，通過酶的固定化人們可以達(dá)到改變酶的立體選擇性的目的[49]。

3.1 選擇固定化方法

不同的固定化方法會對酶的立體選擇性產(chǎn)生重大的影響。例如：從Candida rugosa中得到的酯酶可以用很多不同的方法進(jìn)行固定：疏水性載體上的界面吸附、PEI-包衣載體上的離子鍵吸附、含醛基載體的共價吸附等[50]。這些方法可以賦予酶不同的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，因此影響酶的活力、專一性以及立體選擇性。在催化水解(R,S)-2-phenyl-2-butyroylacetic acid時，界面吸附的酶對S型異構(gòu)體的E值為1.6～85，但共價固定的酶對R型的異構(gòu)體的E值高達(dá)400，聚合物PEI包衣的酶卻只對S型異構(gòu)體有很小的立體選擇性，而水解扁桃酸甲酯時，PEI包衣的載體對S型的異構(gòu)體的E值為300，而共價固定的方法只有 10。CAO 等[51]分別使用CLEA和CLEC的方式對青霉素?；高M(jìn)行固定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CLEA的選擇性幾乎是CLEC的兩倍。以上的例子說明了酶的固定化方法對固定化酶的立體選擇性的影響很大。

3.2 控制固定化條件

固定化過程的控制對于酶的立體選擇性也會產(chǎn)生重要影響，主要因素包括介質(zhì)種類、緩沖體系的pH值、溫度以及添加劑。Francisc等[52]用溶膠-凝膠法來固定商業(yè)酯酶 AK，當(dāng)酶固定在丙基三甲氧基硅烷產(chǎn)生的溶膠-凝膠介質(zhì)中時，立體選擇性最好，比自由酶提高了7倍；同時，固定化酶對不同的底物的立體選擇性也有所不同。Rodrigo等[53]用PEI包衣的瓊脂糖凝膠來固定南極假絲酵母酯酶，考察了制備條件對R,S-扁桃酸甲酯不對稱水解的影響，發(fā)現(xiàn)pH值9.0 和4 ℃下的立體選擇性最好。此外，在固定化過程中添加底物、表面活性劑、冠醚或者其它添加劑如乙酰化葡聚糖、多糖、細(xì)胞萃取物、金屬鹽等都可能對酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生誘導(dǎo)作用[11]，從而改變酶的立體選擇性。

4 簡化酶的提純和回收過程

酶要在工業(yè)生產(chǎn)上大規(guī)模使用，其純品的制備過程必須簡單，固定化酶的回收必須容易。而這兩個問題都可以通過酶的固定化來解決。

4.1 酶的固定化純化

傳統(tǒng)的固定化過程必須事先對酶進(jìn)行純化，費時、費力，并造成生產(chǎn)成本的提高?，F(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)了很多技術(shù)能夠使用粗的細(xì)胞裂解液，在固定化的同時對酶進(jìn)行了純化。Chung等[54]利用油脂蛋白和油體的特異性親和作用來固定d-hydantoinase，首先將 d-hydantoinase植入油質(zhì)蛋白的羧基端，并將融合蛋白在E. coli.中過表達(dá)，就會得到大量的融合蛋白，占整個細(xì)胞重的30%，將植物油和細(xì)胞混合物超聲裂解形成人工油體（AOBs），而通過這樣的方法固定于AOBs表面的d-hydantoinase表現(xiàn)了很高的耐熱性，7輪循環(huán)使用后的固定化酶仍然可以使反應(yīng)達(dá)到80%的轉(zhuǎn)化率。近年來發(fā)展較快的適配體技術(shù)也在酶的固定化純化中得到了應(yīng)用，作者課題組利用適配體和某種蛋白之間的特異性親和作用，可以進(jìn)行蛋白的提純，如果將適配體固定在固體材料上（圖 6），就可以從細(xì)胞裂解液中提純并同時固定化酶，該方法目前已有報道[55]，尚需進(jìn)一步研究。

圖6 磁性微球-適配體固定化酶

4.2 磁性材料

磁性微球可以用于凝膠化和小顆粒的固定化酶分離純化，尤其是納米級的固定化酶。除此之外，還可以利用磁場來控制固定化酶的分散，這就避免了傳統(tǒng)的攪拌對酶結(jié)構(gòu)的機(jī)械損傷，以提高酶的穩(wěn)定性[56]。因此，近年來出現(xiàn)了很多利用磁性材料固定化酶的報道。比較常見的是磁性納米顆粒，包括磁性纖維素微球固定化半乳糖氧化酶[57]、磁性殼聚糖微球固定化漆酶[58]以及磁性高分子聚合物微球固定化Tag聚合酶[55]。除了磁性納米粒，還出現(xiàn)了磁性納米纖維，如用過二硫酸銨做引發(fā)劑，氧化鐵納米粉末存在的條件下，將苯胺單體聚合形成磁性聚苯胺納米纖維，酯酶可以在納米纖維纏結(jié)形成的納米孔中固定，并顯示了高度的穩(wěn)定性[59]。Gülay等[60]先用三價鐵和縮水甘油丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯共聚得到磁性微球，然后將磁性微球上的環(huán)氧基轉(zhuǎn)化為氨基，再與甲基丙烯酸甲酯接枝共聚，在納米球的表面就產(chǎn)生了很多帶負(fù)電荷纖維狀聚合物，胰蛋白酶可以通過靜電吸附固定在這些細(xì)小的纖維之間，并且保持了游離酶活力的84%。目前，以磁性材料為載體的固定化酶在很多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如有機(jī)合成、生物傳感器以及體內(nèi)的藥物靶向傳輸?shù)取?/p>

5 展 望

近幾年來，酶的固定化技術(shù)取得了長足的進(jìn)步，并成為生物化學(xué)研究領(lǐng)域的重點和熱點。研究者不斷對傳統(tǒng)固定化技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，并開發(fā)新的固定化方法，一定程度上改善了一些酶的性能，包括穩(wěn)定性、催化活力、立體選擇性和回收再利用性能，他們用實踐證明了酶的固定化仍然是最好的改善酶的催化性能的手段。

通過調(diào)研，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的固定化方式如吸附、共價結(jié)合、包埋很難制備出性能優(yōu)異的固定化酶?，F(xiàn)代酶固定化技術(shù)涉及了有機(jī)合成化學(xué)、生物、材料、分析等多個學(xué)科領(lǐng)域，未來的研究趨勢必然是多種學(xué)科領(lǐng)域的交叉聯(lián)合，將各個學(xué)科領(lǐng)域的新研究成果應(yīng)用于酶固定化技術(shù)，才能推動酶固定化技術(shù)的長足發(fā)展。

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Progress in enzyme immobilization technique

SUN Jianhua，DAI Rongji，DENG Yulin
（School of Life Science，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China）

Enzyme must be treated properly for properties improvement before implementation at industrial scale，in which enzyme immobilization is the most important and conventional technique.This paper introduces the recent process in enzyme immobilization，including multipoint covalent immobilization，single enzyme nanoparticles，magnetic nanofibers，cross-linked enzyme crystal，cross-linked enzyme aggregate，chaperonin，artificial oil bodies and aptamer. New strategies to obtain immobilized enzyme w ith improved catalytic properties are emphasized，including stability，activity，enantioselectivity，recovery and reuse.

enzyme；immobilization；catalytic properties

Q 814.2

A

1000-6613（2010）04-0715-07

2009-10-23；修改稿日期：2009-12-09。

孫建華（1980—），男，博士研究生。聯(lián)系人：鄧玉林，教授，博士生導(dǎo)師。主要從事生物催化、分析化學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、空間生物學(xué)等方向的研究。電話 010-68913310；E-mail deng@bit.edu.cn。