張超，劉鶴，高詩娟，黃文林,3，王宗燁

1 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室，北京 100101 2 解放軍第306醫(yī)院放療中心，北京 100101 3 中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣州 510060

聚乙烯亞胺包裹小環(huán)DNA形成的納米顆粒傳輸外源基因的性質(zhì)表征

張超1，劉鶴1，高詩娟1，黃文林1,3，王宗燁2

1 中國科學(xué)院微生物研究所 中國科學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)重點實驗室，北京 100101 2 解放軍第306醫(yī)院放療中心，北京 100101 3 中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣州 510060

聚乙烯亞胺(PEI)是一種具有良好生物安全性和生物相容性的非病毒載體，能高效轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞。小環(huán)DNA是一種去除質(zhì)粒細(xì)菌骨架，只含有目的基因表達(dá)框的環(huán)狀DNA分子。與普通質(zhì)粒相比，小環(huán)DNA具有表達(dá)效率高、持續(xù)時間長的優(yōu)勢。使用PEI包裹攜帶報告基因gfp和抑癌基因pten小環(huán)DNA載體，并利用各種技術(shù)手段分析了該傳輸系統(tǒng)的理化性質(zhì)和生物學(xué)效應(yīng)。凝膠阻滯實驗、電鏡實驗及MTT實驗分析結(jié)果表明利用PEI包裹小環(huán)DNA和質(zhì)粒DNA體系性質(zhì)無顯著的差別，并且2種復(fù)合物對細(xì)胞毒性亦無明顯差別；但是動態(tài)光散射實驗結(jié)果顯示由于PEI可以包裹更多數(shù)量的小環(huán)DNA，所以PEI包裹小環(huán)DNA形成的復(fù)合物粒徑要略大于包裹質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物粒徑。熒光顯微鏡實驗、real-time PCR分析和Western blotting 分析結(jié)果表明，PEI包裹小環(huán)DNA形成的復(fù)合物對細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PEI包裹質(zhì)粒DNA所形成的復(fù)合物，并且小環(huán)所攜帶的外源基因的表達(dá)效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于質(zhì)粒DNA所攜帶的外源基因的表達(dá)效率。實驗結(jié)果表明，PEI包裹小環(huán)DNA形成的納米顆粒在細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中具有很高的表達(dá)效率，這一研究結(jié)果為PEI包裹小環(huán)DNA的非病毒載體系統(tǒng)在傳輸外源基因過程中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

聚乙烯亞胺，小環(huán)DNA，gfp基因，pten基因，納米顆粒，基因傳輸

Abstract:Polyethylenimine(PEI)is one of the most characterized non-viral vectors.It can condense DNA in a good manner and achieve high transfection efficiency.Minicircle DNA(mc-DNA)is a novel kind of supercoiled DNA which is devoid of bacterial backbone.mc-DNA is superior to conventional DNA for its higher transfection effciciency and longer time-span.In this study, we combined PEI and mc-DNA in gene delivery system.We investigated the physicochemical and biochemical effects of this non-viral system and further explore its potential in tumor gene therapy.mc-DNA was obtained by recombination of parentalplasmid in the presence of L-arabinose, and complexed with PEI.The results of transmission electron microscopy and scanning electron microscopy showed that the particles were spherical and homogeneous.Through gel retardation assay and MTT assay, we found that there were no obvious differences in binding capability of PEI to mc-DNA and plasmid DNA, as well as in cytotoxicity.The results of dynamic light scattering showed that the size of PEI/mc-DNA was about 68 nm, a slight larger than that of PEI/plasmid DNA.Furthermore, the tumor cells transfected with mc-GFP showed higher GFP expression level than that of conventional plasmid.The same results were achieved in the cells treated with tumor-suppressor gene pten, assayed by RT-PCR and Western blot.It indicates that the system of PEI/minicircle DNA is promising in gene transfer.

Keywords:polyethylenimine, minicircle DNA,gfp,pten, nanoparticle, gene delivery

基因傳輸系統(tǒng)是當(dāng)前研究的一個熱點。目前用于基因傳輸?shù)妮d體可分為病毒載體和非病毒載體 2種。與病毒載體相比，非病毒載體具有安全性高、容易制備和修飾、基因容量大的優(yōu)勢[1-2]。其中，聚陽離子化合物聚乙烯亞胺(PEI)是研究最多和最有效的非病毒載體之一。PEI具有“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，因此能夠很好地復(fù)合帶負(fù)電荷的DNA分子，并且能夠?qū)?fù)合的 DNA 運送到細(xì)胞核內(nèi)，實現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)染[3-5]。小環(huán) DNA是一種去除了細(xì)菌骨架，而只含有目的基因表達(dá)框的新型環(huán)狀DNA，它是由母環(huán)質(zhì)粒DNA在ΦC31重組酶的誘導(dǎo)下重組產(chǎn)生的。研究表明，與普通質(zhì)粒相比，小環(huán)DNA具有表達(dá)效率高、表達(dá)時間長的優(yōu)勢[6-9]。除此之外，小環(huán)DNA因為缺乏質(zhì)粒 DNA 中的抗性基因，因此更為安全[10]。Park等利用PEI包裹攜帶脂聯(lián)素基因的小環(huán)DNA治療II型肥胖糖尿病小鼠，取得了比使用普通質(zhì)粒系統(tǒng)更好的治療效果[11]。但是關(guān)于PEI包裹小環(huán)DNA這一傳輸體系的理化性質(zhì)，以及它在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)等方面的研究尚未見報道。因此，本研究用PEI包裹攜帶報告基因gfp和抑癌基因pten的小環(huán)DNA，并利用各種技術(shù)手段比較該體系相對質(zhì)粒DNA體系的理化和生化性質(zhì)的差別，探討PEI包裹小環(huán) DNA的非病毒載體系統(tǒng)在基因傳輸中應(yīng)用的可行性，并為探索該系統(tǒng)在腫瘤基因治療中的應(yīng)用提供前期的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種和細(xì)胞

p2ΦC31質(zhì)粒由美國斯坦福大學(xué)陳志英教授惠贈；pEGFPN1質(zhì)粒購自美國Clontech公司；pBS-T載體和大腸桿菌TOP10購自中國TIANGEN生物科技有限公司；pShuttle和pCDNA3.1-PTEN由本實驗室保存。人轉(zhuǎn)化腎上皮細(xì)胞系293T、人乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和人肝癌細(xì)胞系HepG2購自美國ATCC。

1.2 主要試劑和材料

L-阿拉伯糖、樹枝狀聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI，MW 25 kDa)、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)等購自美國Sigma-Aldrich公司；限制性內(nèi)切酶和連接酶購自日本 TaKaRa公司；胎牛血清購自Hyclone公司；DMEM購自美國Gibco公司；質(zhì)粒提取試劑盒和TRNzol Total RNA Reagent 購自中國TIANGEN生物科技有限公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)購自美國Promega公司；抗PTEN鼠多克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體購自中山金橋公司。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建

1.3.1p2ΦC31-EGFPN1質(zhì)粒的構(gòu)建

用BglII 和BamH I雙酶切pEGFPN 1質(zhì)粒，將得到的載體片段進(jìn)行自連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，挑取氨芐抗性克隆，酶切鑒定，獲得pEGFPN1-2。以pEGFPN1-2質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到 CMV-EGFP-polyA的基因片段，上游引物：5′-GGACTAGT GTAATC AATTACGGGGTCATTAG-3′，下游引物：5′-GGACT AGT CGCCTTAAGATACATTGATGAGT-3′(下劃線代表SpeI酶切位點)，將得到的目的基因片段克隆到 p2ΦC31載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取氨芐抗性克隆，酶切鑒定，獲得p2ΦC31-EGFPN1。

1.3.2 p2ΦC31-PTEN質(zhì)粒的構(gòu)建

以 pCDNA3.1-PTEN質(zhì)粒為模板擴(kuò)增得到pten的基因片段，上游引物：5′-GCTCTAGA ATGACAGC CATCATCAAAGAG-3′(下劃線部分為XbaI 酶切位點)，下游引物：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCAGACTTTTGTAATTTGTGTAT-3′(下劃線部分為NotI酶切位點)，將擴(kuò)增的片段通過XbaI 和NotI雙酶切后克隆到 pShuttle載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TOP10，挑取氨芐抗性克隆，酶切鑒定，獲得pShuttle-PTEN。用SpeI和EcoR I雙酶切 pShuttle-PTEN得到CMV-PTEN-BGH的基因片段，將該片段連入pBS-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 TOP10，挑取氨芐抗性克隆，酶切鑒定，獲得pBS-T-PTEN。用SpeI和XhoI雙酶切 pBS-T-PTEN，將得到的基因片段克隆到p2ΦC31載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取氨芐抗性克隆，酶切鑒定，獲得p2ΦC31-PTEN。

1.3.3 小環(huán)DNA的誘導(dǎo)和純化

本實驗中的方法步驟是根據(jù) Chen等所介紹的方法稍做改動[7]。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的E.coliTOP10接種到 Tris-borate培養(yǎng)基中，過夜搖菌，當(dāng)OD600約為2.50時離心、收菌，將菌團(tuán)重懸于原液體積1/4的，含1.5%的L-阿拉伯糖的LB(Amp+)培養(yǎng)基中，在32℃搖床上250 r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2～4 h，接下來向菌液中加入其 1/2體積的，含 1%的 L-阿拉伯糖LB(Amp+)培養(yǎng)基(pH 8.0)，隨之將溫度調(diào)至37℃，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2～4 h，收集菌體并用質(zhì)粒提取試劑盒提取小環(huán)DNA。

1.4 復(fù)合物的理化性質(zhì)表征

1.4.1 聚陽離子復(fù)合物的制備

首先，將一定量的PEI溶于150 mmol/L的NaCl溶液中，用0.22 μm的濾膜(Millipore)過濾除菌得到聚陽離子溶液；將提取的DNA溶于超純水中。然后，將一定量的聚陽離子溶液滴加到DNA溶液中，邊滴加邊振蕩，并將形成的復(fù)合物室溫放置15～30 min，制成不同N/P比(PEI中的N原子數(shù)/DNA中的P原子數(shù))的復(fù)合物(DNA濃度為20 mg/L)。

1.4.2 凝膠阻滯實驗

將制備好的復(fù)合物在1%(W/V)的瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳，電泳緩沖液為 Tris-acetate(TAE)，電壓為140 V，電泳時間30 min，電泳結(jié)束后將膠放在溴化乙錠(EB，0.5 mg/L)中染色5 min，用紫外燈(λ=312 nm)進(jìn)行觀察。

1.4.3 動態(tài)光散射法測量顆粒粒徑

將制備的聚陽離子復(fù)合物以3 000 r/min 離心10 min 去除灰塵顆粒，取上清用動態(tài)光散射儀(DynaPro Tian，Wyatt Technology Inc)進(jìn)行測量。每個樣品重復(fù)測量3次。

1.4.4 透射電子顯微鏡(TEM)觀察納米顆粒形態(tài)結(jié)構(gòu)

制備PEI/mc-DNA 復(fù)合物，將制備的復(fù)合物滴加到300目的銅網(wǎng)上，室溫孵育5 min，將顆粒用醋酸鈾染色5 min，用去離子水洗滌，過夜晾干，樣品用透射電子顯微鏡(JEM-1400，Tokyo，Japan)進(jìn)行觀察。

1.4.5 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察納米顆粒形態(tài)結(jié)構(gòu)

用超濾膜收集顆粒，室溫下過夜晾干，將樣品用金包被，然后用兩面導(dǎo)電的膠帶裱在一個stub上，用掃描電子顯微鏡(Quanta 200，F(xiàn)EI company，Holland)進(jìn)行觀察。

1.5 MTT實驗

細(xì)胞以 104/孔接種于 96孔板(邊緣孔用無菌PBS填充)，在5% CO2，37℃條件下孵育24 h，之后換為DMEM無血清培養(yǎng)基，并將不同N/P比的復(fù)合物加入每孔細(xì)胞中。5% CO2，37℃孵育24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀在OD570處測量各孔的吸光值，計算細(xì)胞存活率。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

細(xì)胞在含10% 胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL氨芐和100 mg/L氯霉素的DMEM培養(yǎng)基(37℃，5% CO2)中貼壁生長。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞按1×104/孔接種于96孔板的孔中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到80%～90%時，將培養(yǎng)基換為DMEM無血清培養(yǎng)基并轉(zhuǎn)染特定 N/P比的復(fù)合物，每孔轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的量均為0.3 μg，在 37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育 4～6 h，之后用含10% 血清的DMEM培養(yǎng)基換液，繼續(xù)培養(yǎng)30 h，進(jìn)行后續(xù)的檢測。轉(zhuǎn)染細(xì)胞中GFP蛋白表達(dá)用倒置熒光顯微鏡(Axiovert200，ZEISS，Germany)檢測。

1.7 半定量RT-PCR

收集 5×106的細(xì)胞，用 TRNzol Total RNA Reagent并依據(jù)其說明書提取總 RNA。取 2 μg RNA，1 μg Random Primer，DEPC 水補(bǔ)至 10 μL；70℃水浴變性5 min；冰上驟冷后加入2 μL dNTPs(10 nmol/L)，1 μL RNAse inhibitor，8 μL 5×Reaction Buffer，1 μL M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，DEPC 水補(bǔ)至 40 μL，37℃水浴1 h。然后進(jìn)行PCR，PCR的反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，1 個循環(huán)；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，30個循環(huán)；72℃ 終延伸5 min。pten的上游引物：5′-GAACTGGTGTAATGATATGTGCATATT T-3′，下游引物：5′-ATTTTTTGTTAAAGTAAGTAC TAGATAT-3′；β-actin 的上游引物 5′-CTACAATG AGCTGCGTGTGGC-3′，下游引物：5′-CAGGTCCAG ACGCAGGATGGC-3′。

1.8 Western blotting檢測蛋白表達(dá)

收集處理和未處理的293T細(xì)胞，用IP細(xì)胞裂解液提取總蛋白，用Bradford法測量蛋白濃度，各取40 μg蛋白進(jìn)行12%的 SDS-PAGE凝膠電泳，然后在冰上300 mA條件下轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一定稀釋比例的一抗4℃反應(yīng)過夜，用TBST洗滌3次，再加連接有辣根過氧化物酶的二抗室溫孵育1 h，然后用凝膠成像儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 重組母環(huán)質(zhì)粒和小環(huán)DNA的酶切鑒定

小環(huán) DNA的誘導(dǎo)過程如圖1所示。p2ΦC31-EGFPN1 用SpeI單酶切得到約大于10 kb的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2A)。p2ΦC31-PTEN用插入位點SpeI和XhoI雙酶切得到約9.7 kb的載體片段和約2.3 kb的pten基因片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2C)。pShuttle-PTEN用插入位點XbaI和NotI雙酶切得到約4.0 kb的載體片段和約1.2 kb的pten基因片段，與預(yù)期一致(圖2E)。小環(huán)DNA 的電泳和酶切電泳結(jié)果顯示(圖2B，D)，誘導(dǎo)產(chǎn)生得到的minicircle-GFP(mc-GFP)和minicircle-PTEN(mc-PTEN)的電泳條帶很亮，相比較而言，殘余的母環(huán)和細(xì)菌骨架條帶比較弱。信號強(qiáng)度分析顯示mc-GFP和mc-PTEN的得率均占總DNA的95%以上，說明實驗中小環(huán)的誘導(dǎo)比較完全。

圖1 p2ΦC31-EGFPN1和p2ΦC31-PTEN質(zhì)粒誘導(dǎo)產(chǎn)生小環(huán)DNA的示意圖Fig.1 Diagrams of p2ΦC31-EGFPN1or p2ΦC31-PTEN and production of mc-GFP or mc-PTEN.Flow chart of ΦC31 integrase-mediated intramolecular recombination of p2ΦC31-EGFPN1 and p2ΦC31-PTEN.The resulting products are mc-GFP and mc-PTEN, respectively.BAD: araBAD promoter; araC: araC repressor; attB: bacterial attachment site; attP: phage attachment site;attR: right hybrid sequence; Amp: ampicillin resistance gene.

圖2 p2ΦC31-EGFPN1、p2ΦC31-PTEN和pShuttle-PTEN質(zhì)粒及小環(huán)mc-GFP和mc-PTEN的酶切鑒定Fig.2 Identification of DNA with(+)or without(-)enzyme digestion.(A)p2ΦC31-EGFPN1 and(B)mc-GFP digested with or withoutXhoI.(C)p2ΦC31-PTEN and(D)mc-PTEN digested with or withoutSpeI andXhoI.(E)pShuttle-PTEN digested with or withoutXbaI andNotI.M: DNA marker.

2.2 DNA遷移實驗比較PEI復(fù)合DNA的能力

小環(huán)DNA因為去除了細(xì)菌骨架，所以比普通質(zhì)粒DNA要小(圖1)。由于之前的研究表明，聚陽離子在復(fù)合大小存在差異的質(zhì)粒和siRNA 的能力上存在明顯區(qū)別[12-13]，所以在本實驗中，凝膠阻滯實驗被用來評價小環(huán)DNA與質(zhì)粒DNA大小的差別是否影響 PEI復(fù)合兩者的能力。結(jié)果顯示(圖3)，聚合物PEI在復(fù)合兩種DNA的能力上沒有明顯區(qū)別。在N/P比為4或大于4時，未觀測到有質(zhì)粒DNA和小環(huán)DNA的條帶，說明當(dāng)N/P值為4時，PEI能夠完全復(fù)合這2種DNA。

圖3 凝膠阻滯實驗比較PEI復(fù)合質(zhì)粒DNA和小環(huán)DNA的能力Fig.3 Agarose gel electrophoresis of(A)pEGFPN1 and(B)mc-GFP complexed by PEI at different N/P ratios.Complete retardation of PEI/pEGFPN1 and PEI/mc-GFP were achieved at N/P ratio of 4.

2.3 動態(tài)光散射實驗考察顆粒粒徑

通過動態(tài)光散射法測量PEI復(fù)合質(zhì)粒DNA和小環(huán)DNA后形成的納米顆粒的粒徑，結(jié)果顯示復(fù)合物PEI/pEGFPN1的粒徑為(62.4±0.8)nm，復(fù)合物PEI/mc-GFP的粒徑為(68.4±1.8)nm。PEI復(fù)合小環(huán)DNA形成的顆粒的粒徑大于復(fù)合質(zhì)粒DNA形成的顆粒粒徑，結(jié)果與之前Park等的報道相符合[11]。這可能是由于顆粒內(nèi)小環(huán) DNA的拷貝數(shù)多于質(zhì)粒DNA的拷貝數(shù)引起的。

2.4 電鏡觀察納米顆粒形態(tài)結(jié)構(gòu)

通過透射電鏡(TEM)和掃描電鏡(SEM)觀察PEI復(fù)合小環(huán)DNA形成的納米顆粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)，從圖中可以看出復(fù)合物 PEI/mc-DNA能夠形成大小均一、形態(tài)規(guī)則的納米顆粒(圖4)。

圖4 透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察顆粒的形態(tài)Fig.4 Transmission electron microscopy and Scanning electron microscopy of PEI/mc-DNA polyplexes.The polyplexes were formed in 150 mmol/L NaCl solution with a DNA concentration of 20 mg/L and observed by(A)TEM and(B)SEM.The polyplexes were pointed by arrow.

2.5 MTT法檢測復(fù)合物對細(xì)胞的毒性

我們用MTT法考察小環(huán)DNA和質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物對細(xì)胞毒性的影響，從圖5中可以發(fā)現(xiàn)，2種復(fù)合物對細(xì)胞的毒性隨著N/P比的增加而增加，PEI復(fù)合小環(huán)DNA及復(fù)合質(zhì)粒DNA形成的納米顆粒對細(xì)胞毒性的影響沒有明顯的區(qū)別。

圖5 MTT法檢測復(fù)合物的細(xì)胞毒性Fig.5 Cytotoxicity evaluated with the MTT assay in HepG2(A)and HeLa(B)cells.Results are presented as±s.

2.6 攜帶gfp基因的小環(huán)DNA和質(zhì)粒DNA的表達(dá)量的比較

熒光顯微鏡觀察 293T、MCF-7、HeLa 細(xì)胞中GFP的表達(dá)，結(jié)果顯示(圖6)2種復(fù)合物在不同細(xì)胞中均有較高的轉(zhuǎn)染效率，并且復(fù)合物PEI/mc-GFP的轉(zhuǎn)染效率在不同細(xì)胞中均高于復(fù)合物 PEI/pEGFPN1的轉(zhuǎn)染效率。表明轉(zhuǎn)染小環(huán)DNA形成的復(fù)合物具有比普通質(zhì)粒系統(tǒng)更高的表達(dá)效率。

2.7 RT-PCR比較攜帶pten基因的小環(huán)DNA和質(zhì)粒DNA的表達(dá)量

為進(jìn)一步探索PEI復(fù)合小環(huán)DNA的載體系統(tǒng)應(yīng)用到腫瘤基因治療中的可行性，從RNA水平和蛋白水平比較攜帶抑癌基因pten的小環(huán) DNA和質(zhì)粒DNA系統(tǒng)的表達(dá)量。

RT-PCR的結(jié)果顯示(圖7)，轉(zhuǎn)染了復(fù)合物PEI/mc-PTEN的293T、MCF-7、HeLa細(xì)胞中PTEN的表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)染了復(fù)合物PEI/p2ΦC31-PTEN細(xì)胞中的水平，表明比起普通質(zhì)粒系統(tǒng)，攜帶pten基因的小環(huán)DNA系統(tǒng)具有更高的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

圖6 PEI復(fù)合質(zhì)粒DNA和小環(huán)DNA形成的納米顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后GFP表達(dá)量的比較(100×)Fig.6 Gene transfection efficiency examined by GFP expression in varied cells at N/P ratio of 15(100×).

圖7 RT-PCR比較小環(huán)DNA體系和普通質(zhì)粒DNA體系轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中mRNA水平Fig.7 Analysis of PTEN expression by RT-PCR.Total RNA was extracted, reverse transcribed, and amplified.RT-PCR was carried.1: pCDNA; 2: mc-PTEN; 3: p2ΦC31-PTEN.

2.8 Western blotting比較攜帶 pten基因的小環(huán)DNA和質(zhì)粒DNA在細(xì)胞中的表達(dá)效率

Western blotting 實驗結(jié)果表明(圖8)，mc-PTEN轉(zhuǎn)染的 293T細(xì)胞中 PTEN的表達(dá)量顯著高于p2ΦC31-PTEN轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中PTEN的表達(dá)量，進(jìn)一步從蛋白表達(dá)水平說明小環(huán) DNA系統(tǒng)比普通質(zhì)粒DNA系統(tǒng)具有更高的表達(dá)效率。而mc-PTEN 轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞中這種差別不是很明顯，這可能是由于MCF-7的轉(zhuǎn)染效率比較低造成的。

圖8 Western blotting比較小環(huán)DNA體系和質(zhì)粒DNA體系轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中PTEN基因的蛋白表達(dá)效率Fig.8 Protein expression of PTEN in human 293T cells and MCF-7 cells by Western blotting assay.1: pCDNA; 2:mc-PTEN; 3: p2ΦC31-PTEN.

3 討論

在過去的研究報道中，小環(huán)DNA在細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)染主要是通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的，而用 PEI運載小環(huán)DNA的研究僅有 Park等組成的研究小組進(jìn)行過相關(guān)報道[11]。他們利用PEI運載攜帶脂聯(lián)素基因的小環(huán)DNA治療 II型肥胖小鼠，動物實驗結(jié)果顯示使用小環(huán) DNA系統(tǒng)攜帶的脂聯(lián)素基因的表達(dá)量顯著高于使用普通質(zhì)粒系統(tǒng)的表達(dá)量。除此之外，關(guān)于PEI包裹小環(huán)DNA這一傳輸體系的理化性質(zhì)，以及它在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)效應(yīng)等方面的研究還沒有相關(guān)報道。本研究用 PEI包裹攜帶報告基因gfp和抑癌基因pten的小環(huán)DNA，并利用各種技術(shù)手段比較該體系相對質(zhì)粒 DNA體系的理化和生化性質(zhì)的差別，探討PEI包裹小環(huán)DNA的非病毒載體系統(tǒng)在腫瘤細(xì)胞基因傳輸中的可行性。

研究結(jié)果表明PEI能夠很好的復(fù)合小環(huán)DNA，并且形成均一規(guī)則的納米顆粒，顆粒的粒徑大小為(68.4±1.8)nm。研究表明100 nm左右的納米顆粒，通過血液循環(huán)后能夠很好地富集到腫瘤部位，這主要是由于腫瘤血管存在著200～400 nm的空隙，小于這個尺寸的納米顆粒能夠通過并到達(dá)腫瘤組織，這種性質(zhì)被稱為 enhanced permeability and retention effect(EPR)效應(yīng)[2,14]。因此，將PEI復(fù)合小環(huán)DNA的納米顆粒應(yīng)用于腫瘤基因治療中，可能能夠?qū)崿F(xiàn)被動靶向腫瘤組織，從而減少毒副作用。

通過對理化性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，PEI復(fù)合小環(huán)DNA和復(fù)合質(zhì)粒DNA差別并不是很明顯，但是比較兩者轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后GFP的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，相比較質(zhì)粒DNA系統(tǒng)來說，小環(huán)DNA系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)更為高效的表達(dá)。由于理化性質(zhì)無明顯差別，因此這種差別主要是由于小環(huán)DNA自身的優(yōu)勢引起的。研究表明，質(zhì)粒DNA中的細(xì)菌骨架能夠在空間上順式抑制基因的轉(zhuǎn)錄，小環(huán)DNA由于去除了細(xì)菌骨架而去除了這種抑制作用，因此能夠?qū)崿F(xiàn)更為高效的表達(dá)[15]。

為了進(jìn)一步探討PEI運載小環(huán)DNA的基因傳輸系統(tǒng)在腫瘤治療中的潛在價值，本研究將抑癌基因pten引入到這一系統(tǒng)中，結(jié)果進(jìn)一步表明小環(huán)DNA系統(tǒng)比普通質(zhì)粒DNA系統(tǒng)具有更高的表達(dá)優(yōu)勢，因此能夠發(fā)揮更強(qiáng)的抑癌效果。之前有研究應(yīng)用小環(huán)DNA攜帶 IFNγ治療鼻咽癌的荷瘤小鼠，并且取得良好的效果，小環(huán)DNA在IFNγ的表達(dá)量和治療效果方面都有明顯的優(yōu)勢[16]。本研究的結(jié)果為小環(huán) DNA在腫瘤基因治療方面的可行性提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

然而，PEI復(fù)合小環(huán)DNA的載體系統(tǒng)和普通質(zhì)粒系統(tǒng)類似[17]，能夠?qū)е螺^大的細(xì)胞毒性，因此以后的研究仍需要進(jìn)一步對該系統(tǒng)進(jìn)行修飾和改良，減少對細(xì)胞的毒性和機(jī)體的損傷。

綜上所述，PEI復(fù)合小環(huán)DNA能夠形成均一規(guī)則的納米顆粒，而且形成的復(fù)合物在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染中具有比普通質(zhì)粒系統(tǒng)更高的表達(dá)優(yōu)勢。研究表明PEI復(fù)合小環(huán)DNA的載體系統(tǒng)在基因傳輸中具有比較顯著的優(yōu)勢。

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Polyethylenimine and minicircle DNA based gene transfer

Chao Zhang1, He Liu1, Shijuan Gao1, Wenlin Huang1,3, and Zongye Wang2
1 CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 Radiotherapy Center, the 306thHospital of P.L.A, Beijing 100101, China 3 State Key Laboratory of Oncology in South China, Cancer Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510060, China

Received:March 9, 2010;Accepted:April 7, 2010

Supported by:Knowledge Innovation Program in Chinese Academy of Sciences(No.KSCX1-YW-R-10), National Natural Science Foundation of China(Nos.30901751, 30973448), National Basic Research Program of China(973 Program)(No.2010CB529904).

Corresponding author:Zongye Wang.Tel: +86-10-64872016; E-mail: wangzye@163.com中國科學(xué)院知識創(chuàng)新工程基金項目(No.KSCX1-YW-R-10)，國家自然科學(xué)基金(Nos.30901751, 30973448)，國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(973計劃)(No.2010CB529904)資助。