楊洪亮，張翼鷟，王曉芳，于 泳，趙智剛

（天津醫(yī)科大學(xué) 附屬腫瘤醫(yī)院，天津 300000；天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 血液腫瘤科）

鞣花酸對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用的初步研究

楊洪亮，張翼鷟，王曉芳，于 泳，趙智剛

（天津醫(yī)科大學(xué) 附屬腫瘤醫(yī)院，天津 300000；天津市腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 血液腫瘤科）

目的：探討鞣花酸(ellagic acid)對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用及其機(jī)制.方法：用鞣花酸處理體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，用細(xì)胞增殖試驗(yàn)（MTT法）、克隆形成試驗(yàn)研究ELA對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用，Brdu摻入試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ELA對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA合成、凋亡和細(xì)胞周期的影響.結(jié)果：用ELA處理后，腫瘤細(xì)胞增殖活性降低（p<0.05），克隆形成下降（p<0.005），Brdu標(biāo)記指數(shù)降低（p<0.05），細(xì)胞周期分布改變，凋亡指數(shù)升高（p<0.01），G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加（p<0.01），S期細(xì)胞數(shù)減少（p<0.01），在一定劑量內(nèi)對(duì)正常細(xì)胞無明顯影響.結(jié)論：ELA對(duì)所試腫瘤細(xì)胞的增殖有顯著地抑制作用，其作用機(jī)理可能與抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯有關(guān).

鞣花酸；腫瘤細(xì)胞;增殖抑制；凋亡

鞣花酸是從各種堅(jiān)果，軟果及水生植物中提取出來的一種天然多酚[1,6,7,8]，它具有天然抗氧化，清除體內(nèi)自由基，保護(hù)低氧缺血所致心腦損傷等作用[2，3].目前研究表明，鞣花酸對(duì)前列腺癌有抑制作用[4-8].本研究觀察鞣花酸對(duì)E M T 6細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞S M M C-7 7 2 1及正常肝細(xì)胞L-0 2的作用，通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)觀察鞣花酸對(duì)腫瘤增殖的抑制作用.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 受試物

受試物為鞣花酸，鞣花酸購于清華大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)系藥物藥理學(xué)研究室.R P M I-1 6 4 0購自G i b c o/B R L公司（I nv i t r o g e nC o r p o r a t i o n，U S A），胎牛血清為華西生物研究所產(chǎn)品（中國，成都），胰酶及D M S O均購自北京華美生物技術(shù)公司，噻唑藍(lán)（M T T）、5-溴脫氧尿苷（B r d u）為 S i g m a公司產(chǎn)品，A n t i-B r d u抗體為 Z y m e d公司產(chǎn)品，S-P試劑盒（S P 9 0 0 1）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司.

1.1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)

小鼠乳腺癌細(xì)胞E M T 6、人肝癌細(xì)胞S M M C-7 7 2 1和正常肝細(xì)胞L-0 2購自中科院上海細(xì)胞生物研究所，用含1 0%胎牛血清、1 0 0 U/m l青霉素、1 0 0 μg/m l鏈霉素的 R P M I-1 6 4 0完全培養(yǎng)基，5%C O2，3 7℃培養(yǎng).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞增殖試驗(yàn)（M T T法）

用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×1 04/m l，接種于9 6孔板，每孔2 0 0 μl，培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁，次日分別用不同劑量的 E L A(2.5、5.0、1 0、2 0、4 0 u g/m l)分別處理腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，對(duì)照組不處理，每個(gè)劑量組接種3個(gè)復(fù)孔，置3 7℃，5%C O2培養(yǎng)，分別于培養(yǎng) 1、2、3、4、5天后，取 1個(gè)培養(yǎng)板，每孔加入5 m g/m l M T T試劑1 0 u l，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，再加D MS O 1 0 0 u l，振蕩混勻1 5分鐘，用酶標(biāo)儀（λ=5 7 0 n m）測(cè)定O D值（O D值與活細(xì)胞數(shù)成正比），取其平均值.E L A對(duì)處理細(xì)胞增殖活性的影響表示為：細(xì)胞存活率=處理組O D值÷實(shí)驗(yàn)組O D值×1 0 0%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)

用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度，接種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為3 0 0-4 0 0，每一劑量組接種3孔，培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼壁，次日分別用不同劑量的E L A(2.5、5.0、1 0 u g/m l)分別處理腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，對(duì)照組不處理，置3 7℃，5%C O2培養(yǎng)1 2天，甲醇固定，G i m s a染色，低倍鏡下觀察克隆形成，以大于5 0個(gè)細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)數(shù)各孔克隆數(shù)，取其平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.3 B r d u摻入試驗(yàn)

分別接種腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞置有蓋玻片的六孔板內(nèi)，5×1 05/孔，培養(yǎng)過夜，用5 u g/m l E L A處理細(xì)胞，對(duì)照組不處理.3 6 h后加入B r d u(2 0 μg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng) 1 2 h，固定(甲醇:丙酮=1:1)細(xì)胞貼片，2 M H C l處理3 0 m i n，硼酸緩沖液(p H=8.5)中和 5 m i n，P B S洗 3 m i n×3次，加 B r d u抗體(1:1 0 0)，置4℃過夜，P B S洗3 m i n×3次，加生物素化二抗，3 7℃孵育3 0 m i n，P B S洗 3 m i n×3次，加 s t r e p t a v i d i n/p e r o x i d a s e，3 7℃孵育3 0 m i n，P B S洗3 m i n×3次，D A B顯色，蘇木精復(fù)染.D A B顯色.顯微鏡下計(jì)數(shù)三個(gè)視野下的陽性和陰性細(xì)胞數(shù).計(jì)算陽性細(xì)胞百分率即陽性細(xì)胞百分率＝陽性細(xì)胞數(shù)/（陽性細(xì)胞＋陰性細(xì)胞數(shù)）×1 0 0%.

1.2.4 細(xì)胞周期檢測(cè)(流式細(xì)胞術(shù))

用5 u g/m l E L A分別處理腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，對(duì)照組不處理.4 8小時(shí)后收集各組細(xì)胞，用7 0%乙醇固定，加1%R N A酶3 7℃孵育3 0分鐘，用碘化丙啶（5 0 u g/m l）一步插入法D N A染色，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)D N A含量、細(xì)胞周期分布及凋亡細(xì)胞.

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)資料用方差分析處理，其他實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用卡方檢驗(yàn)處理，如果P﹤0.0 5，認(rèn)為差異有顯著性.

2 結(jié)果

2.1 E L A抑制癌細(xì)胞增殖

E L A對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞增殖均有抑制作用，具有劑量和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系（P<0.0 5）.對(duì)腫瘤細(xì)胞，I C50=5 u g/m l，正常細(xì)胞 I C50=1 0 u g/m l，當(dāng)劑量為2.5 u g/m l時(shí)對(duì)正常細(xì)胞增殖無明顯影響(圖1).

2.2 E L A抑制癌細(xì)胞克隆形成

E L A對(duì)腫瘤細(xì)胞克隆形成有明顯的抑制作用，其抑制作用與E L A劑量成正相關(guān)(P<0.0 5)(圖2).

2.3 E L A抑制B r d u摻入

對(duì)照組小鼠乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞的B rd u標(biāo)記指數(shù)分別為 6 6.2 5%±1.5%，5 9.2 3%±1.6%和6 6.6 7%±1.1%，用5 u g E L A處理3 6 h后，其標(biāo)記指數(shù)分別為4 0.3 9%±1.3%，3 8.9 2%±1.1%和6 3.7 3%±1.3%.E L A處理使腫瘤細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)降低(p<0.0 5，圖3)，對(duì)正常細(xì)胞無影響(p>0.0 5).

2.4 E L A對(duì)細(xì)胞周期的影響

用5 u g/m l E L A處理腫瘤細(xì)胞4 8 h，凋亡指數(shù)和G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加(p<0.0 1)，S期細(xì)胞數(shù)減少(p<0.0 1)，對(duì)正常細(xì)胞無作用(表1).

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要探討了鞣花酸作為一種酚酸類物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用，目前許多實(shí)驗(yàn)研究表明植物多酚具有明顯的防癌抗癌作用[10].鞣花酸屬于黃酮類多酚化合物，對(duì)多種腫瘤具有顯著的抑制作用.因此，鞣花酸防癌抗癌作用的研究已日益受到重視.

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，E L A對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞增殖均有顯著的抑制作用（P<0.0 5），I C50=5 u g/m l時(shí)，并具有劑量、時(shí)間效應(yīng)關(guān)系.實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，E L A對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖具有抑制作用.同時(shí)，E L A對(duì)正常肝細(xì)胞增殖也有一定程度的抑制作用（I C50=1 0 u g/m l）.當(dāng)劑量為 2.5-5 u g/m l時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期無明顯影響.結(jié)果提示，E L A的毒性作用不容忽視.

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，腫瘤細(xì)胞用5 u g/m l E L A處理3 6 h后，B r d u標(biāo)記細(xì)胞顯著低于未處理細(xì)胞(p<0.0 5，圖3)，對(duì)正常細(xì)胞無影響(p>0.0 5)，結(jié)果提示，E L A抑制了腫瘤細(xì)胞D N A合成，使B r d u摻入減少.G l→S轉(zhuǎn)換被認(rèn)為是細(xì)胞周期最重要的調(diào)控點(diǎn)，因?yàn)樗艿皆S多細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)控.G1期阻滯是細(xì)胞增殖抑制的重要環(huán)節(jié)，阻滯后細(xì)胞不能進(jìn)入S期，D N A合成無法完成，干擾了蛋白質(zhì)代謝，從而抑制腫瘤細(xì)胞的分裂.已有的研究表明，鞣花酸對(duì)細(xì)胞周期G1／S轉(zhuǎn)換點(diǎn)的調(diào)節(jié)具有重要作用.本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)E L A處理使腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)和G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加(p<0.0 1)，結(jié)果表明，E L A可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和G 0/G 1期阻滯.

綜上可見，E L A對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用，其作用機(jī)理可能與抑制腫瘤細(xì)胞D N A合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯有關(guān).但其毒副作用亦不容忽視，值得進(jìn)一步深入研究.

表1 E L A對(duì)對(duì)人腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

〔1〕Seeram NP,Lee R，Heber D.Bioavailahillty of ellagic acid in human plasmama after consumption of ellagitannins from pomegranate(Plata granatumL．)juice[J]．Clin Chim Acta.2004,(1—2):63—68.

〔2〕Narayanan BA,Geafroy O,Willingham MC,et a1.p53 ／p21(WAF1 ／CIP1)expression and its possible role in G1 arrest and apoptosis in ellagic acid treated cancer cells[J].Cancer Lett,1999,(2):215—221.

〔3〕Li TM,Chen GW,Su CC,Lin JG,et a1.Ellagic acid indueed p53／p21 expression,G1 arrest and apoptosis in human bladder cancer T24ce11s[j].Anticancex Res,2005,25(2A):971—979.

〔4〕Narayanan BA,Re GG.IGF 一Ⅱdown regulation associated cell cycle arrest in colon cancer cells exposed|to phenolic antioxidant ellagic acid[J].Anticancer Res,2001,21(1A):359—364.

〔5〕Lin SS,Hung CF,Tyan YS,et al.Ellagic[correction of ellagica]acid inhibits arylamine N—acetyltransferase activity and DNA adduct formation in human bladder tulnor cell lines(T24 and TSGH 8301)[J].Urol Res,2001(6):371—376.

〔6〕ELISABETH M G,DANIELAE,ENIKO I.Allelopathic activity of Ceratophyllum demersumL.and Najas marina ssp.Intermedia (Wolfgang)Casper[J].Hydrobiologia,2003,506-509.

〔7〕ALITTA G,GRECA N D,MONACO D,et al.In vito algal growth inhibition by phytotoxins of Typha latifloia[J].J Chen ECOL,1990,16:2637-2646.

〔8〕COPAL B,GOEL U.Competition and allelopathy in aquatic plant communities[J].The Botanical Review,1993,59(3):155-210.

〔9〕Mukherjee A K,Basu S,Sarkar N,et al.Advances in cancer therapy with plant based natural products.Curr Med Chem,2001,8(12):1467~1486.

〔10〕王修杰，袁淑蘭，魏于全 植物多酚的防癌抗癌作用[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005；17(4):508-517.

R 7 3-3 6

A

1673-260X（2010）10-0049-03