郭武華，袁麗華，肖志華，羅良平，余 婷，張吉翔△

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院／江西省分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室：1.腫瘤科；2.消化科 330006）

SUMO－1基因是 SUMO（small ubiquitin－like modifier）基因家族中的一員，主要參與蛋白質(zhì)翻譯后功能的修飾，在轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、核質(zhì)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及染色體分離等方面發(fā)揮重要作用［1－2］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，SUMO－1的修飾調(diào)節(jié)了許多與癌癥發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白的功能，如p53、增殖細(xì)胞核抗原、雌激素受體、端粒酶等［3－7］，提示 SUMO－1基因與癌癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。作者前期研究發(fā)現(xiàn)，SUMO－1基因在肝癌細(xì)胞株SMMC－7721、HepG2、Hep3B以及臨床肝癌標(biāo)本中均明顯高表達(dá)，而癌旁肝組織中SUMO－1基因表達(dá)較低［8］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)臨床肝癌、肝血管瘤及肝局灶性結(jié)節(jié)性增生標(biāo)本中SUMO－1mRNA表達(dá)水平，以進(jìn)一步評(píng)價(jià)SUMO－1基因診斷肝癌的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 肝癌、癌旁肝組織、肝血管瘤及肝局灶性結(jié)節(jié)性增生標(biāo)本均來(lái)自本院外科2007年11月至2008年12月行肝切除患者，均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診。共檢測(cè)20例，其中男16例，女4例。肝細(xì)胞性肝癌術(shù)前甲胎蛋白（AFP）＜8.0 ng／mL（本院正常值上限）4例，肝細(xì)胞性肝癌術(shù)前AFP＞400 ng／mL 4例；肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌4例，肝血管瘤7例，肝局灶性結(jié)節(jié)性增生1例。

1.2 儀器設(shè)備 PCR熱循環(huán)儀（GeneAmp?PCR System 9600）及Gene Genius Match（syngene）全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.3 主要試劑 RNA 提取試劑 Trizol（Invitrogen）、RT－PCR試劑、Oligo（dT，Promega）、M－mLV RT 5×buffer（Promega）、dNTP（Generay Biotech）、Rnase抑制劑（Promega）、M－mLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）、Master Mix（2×Taq PCR，Tiangen）、DNA ladder（Tiangen）等。

1.4 PCR引物 從http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov的 Gen－Bank中獲得人SUMO－1、β－actin基因序列，應(yīng)用 Primer Primier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由Generay Biotech公司合成（表1）。

1.5 RT－PCR檢測(cè)SUMO－1mRNA表達(dá) 采用 Trizol提取肝癌及癌旁肝組織總RNA，合成cDNA。用PCR擴(kuò)增每個(gè)標(biāo)本中SUMO－1基因的表達(dá)，以β－actin作為內(nèi)參照。SUMO－1 PCR通過(guò)94℃預(yù)變性5min，然后94℃、35s，51℃、35s，72℃、35s30個(gè)循環(huán)，72℃延遲延伸7min。β－actin PCR通過(guò)94℃預(yù)變性5min，然后94℃、35s，54℃、35s，72℃、35s 30個(gè)循環(huán)，72℃延遲延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳（含0.5μg／mL溴化乙錠），在紫外線燈下觀察結(jié)果，通過(guò)Gene Genius Match全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)條帶灰度值。各標(biāo)本SUMO－1mRNA表達(dá)量為SUMO－1密度值與各自β－actin灰度值的比值。

表1 PCR反應(yīng)引物

2 結(jié) 果

2.1 SUMO－1mRNA在肝癌中明顯高表達(dá)，而在癌旁肝組織中表達(dá)較低（圖1～3）。12例肝癌標(biāo)本中SUMO－1表達(dá)量為0.513±0.065，而癌旁肝組織中 SUMO－1表達(dá)量為0.05±0.03，兩組SUMO－1mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.009）。

圖1 AFP＞400ng／mL肝細(xì)胞性肝癌及癌旁肝組織中SUMO－1mRNA表達(dá)水平

圖2 AFP＜8ng／mL肝細(xì)胞性肝癌及癌旁肝組織中SUMO－1mRNA表達(dá)水平

圖3 肝膽管細(xì)胞性肝癌及癌旁肝組織中SUMO－1 mRNA表達(dá)水平

2.2 AFP＞400ng／mL肝細(xì)胞性肝癌標(biāo)本中SUMO－1mR－NA表達(dá)水平與AFP＜8.0ng／mL肝細(xì)胞性肝癌標(biāo)本中SUMO－1mRNA表達(dá)水平相近（圖1、2），SUMO－1表達(dá)量分別為0.51±0.08、0.45±0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.426）。

2.3 在肝血管瘤及肝局灶性結(jié)節(jié)性增生標(biāo)本中SUMO－1 mRNA 表達(dá)水平很低（圖4），SUMO－1表達(dá)量為 0.079±0.031，與肝癌標(biāo)本比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.046）。

圖4 肝血管瘤、肝局灶性結(jié)節(jié)性增生及病灶旁肝組織中SUMO－1mRNA表達(dá)水平

3 討 論

SUMO是泛素樣蛋白家族中的一員，與泛素不同，SUMO與底物蛋白結(jié)合后不引起蛋白降解，而是調(diào)節(jié)蛋白功能［9］。越來(lái)越多的蛋白被發(fā)現(xiàn)存在SUMO的修飾，這些蛋白的功能離不開(kāi)SUMO的調(diào)節(jié)作用。SUMO家族蛋白在進(jìn)化中高度保守，在脊椎動(dòng)物中SUMO家族蛋白包括SUMO－1～4，SUMO－1廣泛參與人類(lèi)癌癥相關(guān)蛋白功能的調(diào)節(jié)，促進(jìn)癌癥的發(fā)生、發(fā)展［3－7］。因此SUMO－1與癌癥發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，是癌癥發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。

肝癌是常見(jiàn)惡性肝腫瘤之一，由于起病隱匿、進(jìn)展迅速，治療效果較差。現(xiàn)今診斷肝癌的手段除臨床表現(xiàn)及體征外，影像學(xué)技術(shù)特別是CT、MRI的進(jìn)步在肝癌診斷中發(fā)揮不可或缺的重要作用。AFP是部分肝細(xì)胞性肝癌分泌的蛋白質(zhì)，是診斷肝細(xì)胞性肝癌的一個(gè)重要的參考指標(biāo)。我國(guó)頒布的肝細(xì)胞性肝癌的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)中，AFP具有重要的確診價(jià)值。AFP＞400ng／mL加上有肝癌特征的影像學(xué)檢查，即可確診為肝癌。AFP是我國(guó)診斷肝癌的重要參考指標(biāo)，但不同的肝癌患者其血清AFP水平明顯不同，有些肝細(xì)胞性肝癌患者外周血AFP在正常值范圍，因此尋找一種廣泛存在于肝癌中能夠協(xié)助診斷肝癌的標(biāo)志物具有重要意義。

有研究發(fā)現(xiàn)，在mRNA及蛋白水平SUMO－1基因在肝癌標(biāo)本中均明顯高表達(dá)，而癌旁肝組織中SUMO－1基因表達(dá)較低［8］。通過(guò)RNAi方法，抑制肝癌細(xì)胞株SMMC－7721中SUMO－1的表達(dá)，可明顯抑制 SMMC－7721的生長(zhǎng)［10］，提示 SUMO－1與肝癌發(fā)展關(guān)系密切。本研究采用RT－PCR方法，檢測(cè)肝癌、癌旁肝組織及肝良性腫瘤中SUMO－1mRNA表達(dá)水平，并與臨床常用的肝細(xì)胞性肝癌標(biāo)志物AFP對(duì)比研究SUMO－1 mRNA診斷肝癌的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果顯示，在肝癌標(biāo)本中SUMO－1mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁肝組織，也明顯高于肝血管瘤及肝局灶性結(jié)節(jié)性增生標(biāo)本。盡管在不同肝細(xì)胞性肝癌患者血清中存在AFP量的差異，但在不同肝細(xì)胞性肝癌標(biāo)本中SUMO－1mRNA均明顯高表達(dá)，不同AFP水平患者肝細(xì)胞性肝癌標(biāo)本中SUMO－1mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異，因此鑒于在所有肝癌標(biāo)本中均有SUMO－1mRNA高表達(dá)，SUMO－1 mRNA可成為診斷肝癌的一個(gè)有價(jià)值的指標(biāo)。

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