朱 月，包 楠

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

青春牡丹多糖對(duì)自由基清除作用的研究

朱 月，包 楠

（赤峰學(xué)院 生命科學(xué)系，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

采用鄰二氮菲-Fe氧化法測(cè)定了青春牡丹多糖清除羥自由基（·OH）的作用，應(yīng)用鄰苯三酚自氧化反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O2-）的方法測(cè)定青春牡丹多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用.結(jié)果表明，青春牡丹多糖具有清除羥自由基的作用，且呈明顯的量效關(guān)系；對(duì)超氧陰離子自由基也具有清除作用.該結(jié)果提示青春牡丹多糖具有抗氧化作用.

青春牡丹多糖；羥自由基；超氧陰離子自由基；抗氧化作用

青春牡丹（Paeonia rockii‘Qing Chun’）是芍藥科芍藥屬牡丹組紫斑牡丹品種群中的一個(gè)品種的變種.

紫斑牡丹是我國(guó)特有植物，為落葉灌木，是珍貴的花卉種質(zhì)資源.牡丹自古以來(lái)皆用根皮入藥.根皮中以牡丹酚為主要的藥用成份，具有抗菌、降血壓、清熱涼血、活血化瘀的功能[1].關(guān)于牡丹多糖對(duì)自由基清除作用的研究卻很少見(jiàn)報(bào)道.

本文以青春牡丹葉片多糖為試驗(yàn)材料，通過(guò)鄰二氮菲-Fe氧化法、鄰苯三酚自氧化法分別測(cè)定青春牡丹多糖對(duì)羥自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O2-）的作用，以探討青春牡丹多糖的抗氧化作用.為紫斑牡丹的進(jìn)一步利用提供科學(xué)根據(jù)，提高紫斑牡丹的藥用價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值.

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

青春牡丹葉片干制粉末由內(nèi)蒙古赤峰學(xué)院趙雪酶老師主持的“紫斑牡丹的引種馴化”課題組提供.

1.2 儀器與試劑

DZKW—4恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司），分析天平（上海天平儀器廠），TD低速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司），UV-9100型紫外分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司），Milli-Q超純水純化系統(tǒng).

無(wú)水乙醇、三氯乙酸、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、鄰二氮菲、鄰苯三酚、FeSO4，H2O2，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，鹽酸，三羥基甲基氨基甲烷，以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?超純水從實(shí)驗(yàn)室Milli-Q超純水純化系統(tǒng)獲得.

2 方法

2.1 多糖的提取和純化[2-5]

稱取100目過(guò)篩干燥的青春牡丹葉片粉末10g，加入80%乙醇80ml，于80℃恒溫水浴浸提40min,4000r/min離心20min，收集上清液.將沉淀再浸提一次.合并兩次上清液，再將上清液與10%三氯乙酸按12：1混勻，冷藏靜置24小時(shí)，離心15min,棄蛋白質(zhì)沉淀.將除掉蛋白質(zhì)的上清液加入適量無(wú)水乙醇,使上清液含醇量達(dá)80%，再將上清液濃縮至10ml，得青春牡丹粗多糖溶液.

2.2 多糖含量的測(cè)定[6]

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

配制質(zhì)量濃度為0.04mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液,低溫保存?zhèn)溆?

分別取0.04mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml于10ml的試管中，不足1.0ml的用去離子水補(bǔ)齊，向試管中分別加入苯酚溶液2.0mL和濃硫酸4.0mL混勻，靜置5min,于60℃的水浴中保溫30min,490nm處測(cè)吸光值，以吸光度A為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度C（ug/mL）為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程.

2.2.2 樣品液的制備

取青春牡丹粗多糖溶液0.1ml置于100ml容量瓶中，用去離子水定容至刻度，制成多糖樣品液于低溫處保存?zhèn)溆?

2.2.3 樣品多糖含量的測(cè)定

取1ml青春牡丹多糖樣品液于干燥的試管中，向試管中加入苯酚溶液2ml和濃硫酸4ml，靜置5min,于60℃的水浴中30min.490nm處測(cè)吸光度，重復(fù)三次，將光吸收值的平均值代入直線方程，計(jì)算青春牡丹多糖的含量.

2.3 青春牡丹多糖對(duì)羥自由基的作用[7-9]

取干燥潔凈的試管按表1加入各試劑，每加入一種試劑要立即搖勻，在樣品對(duì)照管和加樣管中分別加入濃度為0.1256mg/ml青春牡丹多糖樣品液0ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml.使各樣品管所含 多 糖 的 濃 度 分 別 0，0.00628，0.01256，0.01884，0.2512，0.03410mg/ml.最后加超純水使每試管的總體積為10ml.37℃水浴保溫1小時(shí),于536nm比色測(cè)定吸光度.計(jì)算羥自由基清除率.

羥自由基清除率（d）=[A536（加樣）-A536（損傷）-A536（樣品對(duì)照）]/[A536（未損傷）-A536（損傷）]×100%

表1 加樣順序表

2.4 青春牡丹多糖對(duì)超氧陰離子自由基的作用[10]

2.4.1 自氧化速率的測(cè)定

取兩支試管按表2加入25℃預(yù)熱的緩沖液,然后加入預(yù)熱的鄰苯三酚（空白管用0.01mol/L HCl代替鄰苯三酚），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在320nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測(cè)定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化.

表2 加樣順序表

2.4.2 樣品的活性測(cè)定

各試管試劑成分見(jiàn)表3.測(cè)定方法同2.4.1.所不同的是要對(duì)加入同體積不同濃度多糖溶液的樣品空白管的光吸收值和樣品管鄰苯三酚自氧化速率分別進(jìn)行測(cè)定.計(jì)算清除率.

表3 加樣順序表

清除率(I%)計(jì)算公式為:I%＝ [A1-(A3-A2) /A1]×100%

3 結(jié)果

以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的光吸收值為縱坐標(biāo)作圖，得直線方程Y＝0.0102x-0.0047,相關(guān)系數(shù)r＝0.9995.標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度在8.0–40.0ug/ml范圍內(nèi)葡萄糖的含量與吸光度呈良好的線性關(guān)系.依據(jù)直線方程，求得青春牡丹葉片多糖含量為10.1%.

在 2.3中青春牡丹多糖濃度在 0.05～0.25mg/ml時(shí)，對(duì)羥自由基的清除率為14.21%～98.48%（見(jiàn)圖1）.

在 2.4中青春牡丹多糖濃度在 0.01～0.07mg/ml時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率為4.9%～8.1%（見(jiàn)圖2）.

4 討論

在試驗(yàn)研究中由于提取的粗多糖溶液存在雜質(zhì)，對(duì)光吸收值的測(cè)定產(chǎn)生一定的影響.因此，在兩項(xiàng)光吸收值測(cè)定時(shí)設(shè)置樣品空白管可去除雜質(zhì)對(duì)吸光度的干擾，以提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度.

在反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基（·OH）體系中，鄰二氮菲與Fe2+反應(yīng)生成Fe2+-鄰二氮菲配合物，該配合物在A536nm有最大吸收.而當(dāng)·OH氧化Fe2+-鄰二氮菲成Fe3+-鄰二氮菲時(shí)，就使A536nm最大吸收消失或減弱.當(dāng)反應(yīng)體系中存在羥自由基（·OH）清除劑時(shí)，此氧化過(guò)程受到抑制，A536nm則降低不明顯，故可通過(guò)A536nm值比較抗氧化劑清除?OH的能力[13].

本試驗(yàn)在反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基（·OH）體系中加入一定濃度的青春牡丹多糖溶液后，通過(guò)光吸收值的測(cè)定和羥自由基清除率的計(jì)算發(fā)現(xiàn)：青春牡丹多糖對(duì)羥自由基有很好的清除作用.并且隨著多糖濃度的增加，對(duì)羥自由基的清除作用增強(qiáng)，且呈明顯的量效關(guān)系.

鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2-，生成帶色的中間產(chǎn)物，這些中間物在320nm波長(zhǎng)處有強(qiáng)烈的光吸收，并且中間物的積累在初始的4min范圍內(nèi)與時(shí)間成線性關(guān)系.據(jù)此，在初始的時(shí)間范圍內(nèi)，中間物光吸收值的大小與時(shí)間也呈線性關(guān)系.若鄰苯三酚自氧化體系中有抗氧化劑存在，由于它能催化O2-與H+結(jié)合生成O2和H2O2，從而阻止了中間產(chǎn)物的積累，光吸收值降低.

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鄰苯三酚自氧化體系中加入不同濃度的青春牡丹多糖溶液時(shí)，光吸收值降低，說(shuō)明青春牡丹多糖能催化O2-與H+結(jié)合，從而減少體系中的超氧陰離子自由基.數(shù)據(jù)顯示：青春牡丹多糖在一定的濃度范圍內(nèi)對(duì)超氧陰離子自由基有一定的清除能力.

5 結(jié)論

試驗(yàn)證明青春牡丹多糖在一定的濃度范圍內(nèi)，對(duì)羥自由基有較好的清除作用，并且隨著多糖濃度的增加，對(duì)羥自由基的清除作用增強(qiáng)，且呈明顯的量效關(guān)系；對(duì)超氧陰離子自由基也有清除作用，但清除能力較弱.

青春牡丹多糖能有效清除自由基,說(shuō)明具有一定的抗氧化作用.具有很好的開(kāi)發(fā)利用前景.

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S685.11

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1673-260X（2010）02-0019-03