姜 輝 吳芙蓉 薛 雪 張家富

肝纖維化是慢性肝病重要的病理特征，也是肝硬化發(fā)生的前奏和必經(jīng)的中間環(huán)節(jié)，研究表明肝纖維化完全有逆轉(zhuǎn)的可能[1，2]。肝樂顆粒為安徽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院用于治療急慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化活動期、肝炎病毒攜帶者的經(jīng)驗方，具有疏肝理脾、活血解毒、兼以扶正利膽退黃之功效，在長期的臨床實踐中顯示出很好的療效。本研究通過復(fù)制CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，觀察肝樂顆粒對肝纖維化大鼠纖維化指標的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）藥物：肝樂顆粒（安徽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑）、秋水仙堿（西雙版納版納藥業(yè)有限責任公司）。（2）試劑：CCl4（汕頭市西隴化工廠）；透明質(zhì)酸（HA）試劑盒、層粘蛋白（LN）試劑盒、PⅢNP試劑盒、四型膠原（CⅣ）試劑盒、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β1）試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所）；Trizol試劑（Introgen life technologies公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒（Fermentas公司）。（3）動物：SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量 180 ～220g，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（蘇）2008-0004。（4）儀器：8453E紫外分光光度計 （美國安捷倫公司）；電子顯微鏡XDS-1B（重慶光電儀器總公司）；Hemal 8R冷凍離心機、壓縮機制冷式基因擴增儀、GSG2000核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)（珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司）。

1.2 方法 （1）分組及造模：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后隨機分為正常組、模型組肝樂顆粒低 （1.5g/kg）、中 （3g/kg）、高 （6g/kg）劑量組和秋水仙堿組 （0.1×10-3g/kg）；每組各10只。除正常對照組外，其余各組分別于大鼠背部皮下注射50％CCl4（0.1mL/100g），正常組給予等量花生油，每周2次，連續(xù)12周。第7周，各給藥組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，每天1次，連續(xù)6周。末次給藥后，禁食8h處死動物。（2）一般形態(tài)學觀察：大鼠行動、毛色、飲食、體重等變化情況。（3）血清學指標檢測：常規(guī)分離血清，放免法測定 HA、LN、PⅢNP、CⅣ、TGF-β1的含量，具體操作按說明書進行。（4）RT-PCR測定肝組織Ⅰ型前膠原mRNA表達：取100mg大鼠肝臟組織，采用Trizol法抽提RNA，總反應(yīng)體系20μL，42℃水浴1h，合成第一鏈cDNA。取上述逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1uL作為反應(yīng)模板，反應(yīng)體系為25uL。Ⅰ型前膠原：5-TACAGCACG CTTGTGGATG-3（上 游 ）； 5-TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC-3（下游）。擴增條件為：94℃預(yù)變性 5min，94℃變性 40s，51℃ 退火40s，72℃延伸1min，32個循環(huán)，再72℃延伸10min，4℃保存。β - actin：5-TGGAATCCTGTGGCATCCATGA AAC-3（上游 ）；Forward：5-ACGCAGCTC AGTAACAGTCCG-3（下游）。擴增條件為：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 4 0s，51℃ 退火 4 0s，72℃延伸1min，32 個循環(huán)，再 7 2℃延伸10 min，4℃保存。以 5 μL PCR 產(chǎn) 物在凝膠上電泳，攝像，存入計算機，并作圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般形態(tài)學改變情況 造模前，各組大鼠健康狀態(tài)良好，進食、飲水正常，大便成形，毛色有光澤；造模3～5周后，除正常組外，其余各組大鼠均表現(xiàn)為易激惹，進食量及飲水量明顯下降，大便不成形，毛色無光澤，體重下降，符合CCl4造模時的主要體征；給予受試藥物后，肝樂顆粒各劑量組進食、活動、毛色、體質(zhì)量較模型組有明顯改善。

2.2 各組大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ含量比較 見表1。與正常組比較，模型組大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，肝樂顆粒低、中、高劑量組肝纖維化大鼠升高的HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平顯著降低（P ＜0.05或 0.01）。

2.3 各組血清TGF-β1含量比較 見表1。與正常組比較，模型組大鼠血清TGF-β1水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，肝樂顆粒低、中、高劑量組肝纖維化大鼠TGF-β1水平顯著降低（P ＜ 0.05）。

表1 各組血清相關(guān)指標比較（ng/mL，±s）

表1 各組血清相關(guān)指標比較（ng/mL，±s）

與正常比較，*P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P＜0.01

組 別正常組模型組肝樂顆粒低劑量組肝樂顆粒中劑量組肝樂顆粒高劑量組秋水仙堿組n 10 10 10 10 10 10 HA 126.23±26.37 219.26±29.09*180.72±45.36△169.56±34.01△△176.61±43.13△172.28±42.35△LN 67.38±15.50 102.46±17.08*80.77±16.32△84.44±20.88△72.19±18.82△△83.24±20.74△PⅢNP 56.69±7.81 84.39±19.75*76.30±13.98 66.96±11.53△△70.08±11.14△69.37±9.77△CIV 71.66±9.08 102.30±13.52*91.09±14.84△83.36±10.30△△88.91±14.88△84.36±10.48△△TGF-β1 8.09±3.13 23.89±6.77*18.60±4.41△19.36±5.19△18.47±4.89△18.67±3.45△

2.4 各組肝組織Ⅰ型前膠原mRNA表達的影響 見圖1。RT-PCR結(jié)果分析顯示，模型組肝臟Ⅰ型前膠原mRNA的表達顯著高于正常組，而肝樂顆粒低、中、高劑量組Ⅰ型前膠原mRNA的表達下降。

圖1 各組大鼠肝組織中Ⅰ型前膠原mRNA表達的影響

3 討論

目前肝纖維化的血清標志物主要有以下幾種。（1）HA：由間質(zhì)細胞合成，絕大多數(shù)存在于組織間隙或結(jié)締組織中，血清HA水平的增高與肝維化的程度呈正相關(guān)，可以較好地反映已生成的纖維化程度，是較敏感的反映肝纖維化損害程度的定量指標[3]。（2）LN：為基底膜中特有的非膠原性結(jié)構(gòu)糖蛋白，血清LN值被認為是反應(yīng)基底膜更新率的指標，可反映竇毛細血管化和匯管區(qū)纖維化的范圍[4]。（3）PⅢNP：主要在活化的肝星狀細胞內(nèi)合成和釋放，肝纖維化時肝星狀細胞被激活大量合成PⅢNP。因此，PⅢNP能可靠地反映肝纖維化的活動程度及肝病患者的肝臟組織學改變[5]。（4）CⅣ：為構(gòu)成基底膜的主要成分，反映基底膜膠原的更新率，CⅣ含量的增高可較靈敏反映出肝纖維化過程，是肝纖維化的早期標志之一[6，7]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清HA、LN、PⅢNP、CⅣ均明顯高于正常組，表示造模成功；與模型組相比，肝樂顆粒各劑量組均能顯著降低肝纖維化大鼠升高的HA、LN、PⅢNP、CⅣ水平，提示肝樂顆粒具有抗肝纖維化作用。

在肝纖維化發(fā)展過程中，活化的肝星狀細胞是細胞外基質(zhì)的主要產(chǎn)生細胞，多種細胞因子參與了肝星狀細胞的活化，其中TGF-β1是最有效的細胞因子。TGF-β1在肝纖維化過程中的主要作用是激活肝星狀細胞，促使細胞外基質(zhì)產(chǎn)生增加，細胞外基質(zhì)不僅僅是量的明顯增加，同時還伴有質(zhì)的改變，如竇周的低密度基底膜膠原（Ⅳ、Ⅴ型為主）變?yōu)楦呙芏鹊拈g質(zhì)膠原（Ⅰ、Ⅲ型膠原為主）[8，9]。本研究顯示，肝樂顆粒能顯著降低肝纖維化大鼠血清TGF-β1水平，同時可抑制肝纖維化大鼠肝組織中Ⅰ型前膠原mRNA的表達，提示肝樂顆粒能有效降低細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗纖維化的作用。

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