成玲俐,吳素華,李志梁,唐,張 瑞

(1.南海鹽步醫(yī)院,廣東佛山528247;2.中山大學附屬第一醫(yī)院;3.南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院)

在動物體內阻斷左冠狀動脈前降支(LAD)造成急性心肌缺血,并在預定時間內恢復血供予以再灌注,是模擬人類缺血性心臟病恢復血供治療必需的實驗方法。由于大鼠在進化關系上比較接近人類,且其冠狀動脈側支循環(huán)少、心肌壞死出現(xiàn)早、心律失常發(fā)生率高、穩(wěn)定性好,且大鼠制作模型費用低廉,從而成為制作心肌缺血再灌注損傷模型的首選,結扎大鼠LAD形成心肌梗死是目前國內外公認的模型制備方法。但以往模型制備過程中存在諸多不便,如:手術時反復多次將心臟牽拉到胸腔外,造成動物死亡率增加,加大了實驗成本,又加大了動物的創(chuàng)傷;阻斷冠狀動脈造成缺血后實現(xiàn)再通時,結扎線不易剪斷,常導致左心耳破裂,引起心臟撕脫傷,造成大出血;文獻報道冠狀動脈的定位部位不一,會造成模型缺血損傷部位及損傷程度不一致等。參照不同研究人員采用的模型制備方法[1],結合本實驗室條件對該模型制作進行了改進,以提高模型制備成功率?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 清潔級SD大鼠,體重220-260 g,雄性,合格證號:SCXK(粵)2008-0020。由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為 3組:假手術組(Sham組),僅穿線,不結扎LAD;缺血組(Ischemia組),單純結扎LAD30 min;缺血再灌注組(IR組),結扎 LAD30 min,再灌注120 min。每組20只。

1.1.2 主要儀器和器械 動物呼吸機ALC-V8(上海奧爾科特生物科技有限公司),澳大利亞產(chǎn)Powerlab16導生理記錄儀,無創(chuàng)縫合針(上海醫(yī)菱醫(yī)療器械有限公司);黑色醫(yī)用縫合線、l0ml一次性無菌注射器、各種手術器械,如止血鉗、小無齒彎鉗、小鑷、小眼科剪等。

1.1.3 主要藥品 乙醚、注射用青霉素鈉、硫酸慶大霉素注射液、無菌生理鹽水注射液。

1.2 實驗方法

1.2.1 術前準備及實驗大鼠人選標準 大鼠行腹腔注射20%的烏拉坦(0.6 ml/100 g)麻醉后,仰臥位固定于手術臺上,行右頸總動脈導管到頸總動脈和左心室與壓力換能器相連,經(jīng)放大器測量股動脈血壓和左心室內壓。標準Ⅱ導程導聯(lián)與放大器相連,記錄心電圖,用心電R波計算心率。連接心電圖,肢體導聯(lián)監(jiān)測心電,記錄標Ⅱ導聯(lián)心電圖各1 min,有異常者剔除。

1.2.2 胸部手術 插氣管接人工呼吸機,胸部去毛,碘伏消毒。沿著鎖骨中線縱行切開皮膚約2cm,在第三或第四肋間用止血鉗逐層游離皮下組織、肌肉,打開胸腔,以擴胸器擴大胸腔,可清晰看到心臟搏動的暗影,剪開心包,在動脈圓錐與左心耳之間,左心耳下緣約3 mm處結扎掛線左冠狀動脈前降支實行心肌缺血,然后迅速將心臟送回胸腔,醫(yī)用縫合線的兩端留置體外備用。用長嘴止血鉗將胸部皮膚和肌肉以及心臟掛線夾緊,防止氣胸發(fā)生,觀察心電圖變化。T波高聳或者倒置為心肌缺血標志。如心電圖改變不明顯,則稍松開止血鉗,拉緊一端線頭,則明顯看到心電圖改變。再灌注時,松開止血鉗,放松掛線,形成再灌注模型。造模結束時,按層次依次縫合肌肉、皮膚,切口處注射少許青霉素注射液,再次碘伏消毒,預防感染。

1.2.3 心肌缺血和再灌注模型制備成功的標志 造模后,心電圖表現(xiàn)為ST段抬高和(或)T波高聳或者倒置呈弓背向上單向曲線為心肌缺血標志;再灌注損傷模型成功標志為再灌注后,抬高的ST段下降50%以上或高聳的T波下降(后期可作病理學檢查證實)。

1.3 觀察指標

1.3.1 模型制備情況 觀察各組的造模成功率。

1.3.2 心電圖改變 通過觀察心電圖ST位移值和N-ST(計算位移高于0.1 mv的數(shù)量)的改變可反映心肌缺血程度。

1.3.3 外周血中LDH、CK-MB的含量測定 缺血4 h,腹腔靜脈取血2 ml,離心,取血清,以全自動生化分析儀檢測乳酸脫氫酶(LDH)、CK-MB的含量。

1.3.4 心肌病理組織學檢查 另取結扎以下0.5 mm處心肌組織小片置4%多聚甲醛保存超過48 h。每個組織塊均酒精梯度脫水,石蠟包埋,切片厚約4 μ m,進行蘇木素一伊紅(Haematoxylin-Eosin,HE)染色。光鏡下觀察心肌組織病理學變化。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 模型制備情況

假手術組(Sham組),缺血組(Ischemia組),缺血再灌注組(IR組)三組,每組20只大鼠,造模成功數(shù)分別為19只,20只,18只,成功率分別為 95%、100%、90%。各組間模型鼠造模成功率的比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。

2.2 對缺血大鼠心電圖的影響

IR組ST位移值和N-ST均明顯小于缺血組(與假手術組比較 P＜0.05或 P＜0.01)(表1,2),再灌注后倒置的T波變成正向抬高,有的大鼠可合并出現(xiàn)各種缺血性心律失常的心電圖表現(xiàn)。上述心電圖表現(xiàn)符合大鼠心肌缺血及再灌注損傷模型的心電圖變化,說明此改進造模方法是成功的。

表1 各處理組大鼠心電圖ST段(mV)、ST位移植的影響(n=20,±s)

表1 各處理組大鼠心電圖ST段(mV)、ST位移植的影響(n=20,±s)

與缺血前比較,*為P＜0.05,**為P＜0.01;IR與假手術組比較,#為 P＜0.01;與缺血組比較,Δ為P＜0.05,ΔΔ為P＜0.01

檢測指標 組別 缺血前 缺血再灌注(min)30 60 90 120 ST位移值(MV) 假手術組 0.08±0.06 0.07±0.06 0.07±0.09 0.08±0.08 0.08±0.08缺血組 0.03±0.01 0.25±0.12** 0.29±0.14** 0.28±0.14** 0.28±0.13**IR組 0.06±0.08 0.17±0.08* 0.20±0.09* 0.20±0.08* 0.21±0.08**ST位移值(%) 假手術組 0±0 0.02±0.01 0.03±0.02 0.03±0.02 0.03±0.02缺血組 0±0 0.22±0.13 0.27±0.14# 0.26±0.14# 0.26±0.13#IR組 0±0 0.14±0.04 0.14±0.07 0.15±0.05 0.15±0.02

2.3 再灌注對缺血大鼠血清酶(LDH,CK-MB)水平的影響

再灌注后可降低心肌缺血大鼠血清LDH和CKMB水平,其中指標CK-MB變化最為顯著,與缺血組比較(1 109±245 U/L Vs 1 513±335 U/L)差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.4 心肌病理組織學檢查

假手術組:心肌細胞排列整齊、無變性、間質無水腫、出血。缺血組:心肌細胞排列紊亂、局部變性、間質水腫、出血明顯可見,心肌肌漿呈嗜伊紅染色,橫紋模糊不清或消失,肌纖維及肌絲明顯紊亂,間質有炎性細胞浸潤。IR組:水腫、變性較缺血組減輕,心肌纖維素紊亂,局部呈波紋狀改變,部分肌纖維溶解液化,心肌間質可出現(xiàn)少量紅細胞(圖1)。

圖1 心肌病理組織學檢查

3 討論

急性心肌梗死是心血管疾病中致死率最高的疾病,減少其發(fā)生率、降低其死亡率、改善患者生活質量,是當前醫(yī)學研究的熱點,其中研究最多的是心肌缺血再灌注損傷[2]。目前國內外應用最廣泛的方法是結扎大鼠冠狀動脈左前降支所致局灶性心肌缺血,通過狹窄或完全閉塞冠狀動脈,使其供應區(qū)血流減少或缺如,造成心肌缺血。心肌因缺血、缺氧而發(fā)生代謝紊亂以致發(fā)生凝固性壞死,其發(fā)病過程與機制和臨床相似。

傳統(tǒng)制備大鼠心肌缺血再灌注模型方法主要有兩種[3]:使用人工呼吸的心臟原位結扎和胸腔外結扎。后者模型的優(yōu)點是心臟被拉到胸腔外,操作可視性強,但是在進行心肌缺血預處理實驗時,需要反復多次將心臟牽拉到胸腔外,常常會造成動物死亡,加大了實驗成本。前者是在由呼吸機維持呼吸的條件下,開胸暴露心臟后,通過推管或壓管阻斷冠狀動脈造成缺血,缺血一定時間后去掉管恢復血液灌注。這種方式的優(yōu)點手術操作是在呼吸機的引導下完成,可有充裕的時間進行操作,且心臟處于正常解剖位置,對心臟生理功能影響較小;缺點是由于在胸腔內進行結扎冠狀動脈的操作,視野小、心臟不易固定。我們在前者基礎上,利用擴胸器擴大胸腔術野,然后在動脈圓錐與左心耳之間,左心耳下緣處結扎掛線左冠狀動脈前降支實行心肌缺血,然后將心臟送回胸腔,縫合線的兩端留置體外備用。用止血鉗將胸部皮膚和肌肉以及心臟掛線夾緊,防止氣胸發(fā)生,觀察心電圖變化。如心電圖改變不明顯,則稍松開止血鉗,拉緊一端線頭,則明顯看到心電圖改變。再灌注時,松開止血鉗,放松掛線,形成再灌注模型?？扇绱朔磸投啻卧俟嘧?。除去死亡和不符合模型要求者(結扎后心電圖J點升高不明顯),造模成功率達90%以上,較好滿足了實驗需要。

在I/R過程中,心電圖ST段的抬高與高尖的T波融合,甚至病理性Q波的出現(xiàn),各種心律失常的出現(xiàn)都能準確地反映大鼠I/R過程中心電生理的變化,因此,術前和術中對大鼠心電圖的監(jiān)測是客觀評價模型制作是否成功的標準之一。

缺血再灌注組(IR組)ST位移值和N-ST均明顯小于缺血組(與模型組比較P＜0.05或P＜0.01),心電圖表現(xiàn)為T波倒置呈弓背向上單向曲線,再灌注后倒置的T波變成正向抬高,有的大鼠可合并出現(xiàn)各種缺血性心律失常的心電圖表現(xiàn)。上述心電圖表現(xiàn)符合大鼠心肌缺血及再灌注損傷模型的心電圖變化,說明此改進造模方法是成功的。另外,再灌注后可降低心肌缺血大鼠血清LDH和CK-MB水平,其中指標 CK-MB變化最為顯著,與模型組比較(1 109±245 U/L Vs 1 513±335 U/L)差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。從病理學上,我們可以觀察到假手術組的心肌細胞排列整齊、無變性、間質無水腫、出血。缺血組的心肌細胞排列紊亂、局部變性、間質水腫、出血明顯可見,心肌肌漿呈嗜伊紅染色,橫紋模糊不清或消失,肌纖維及肌絲明顯紊亂,間質有炎性細胞浸潤。與缺血組比較,IR組的心肌組織間水腫、變性較輕,心肌纖維素紊亂,局部呈波紋狀改變,部分肌纖維溶解液化,心肌間質可出現(xiàn)少量紅細胞。

綜上所述,改進的造模方法能夠提高造模的成功率和動物的成活率,降低手術難度,準確地復制心肌I/R的實驗模型,可靠性強、操作簡便、重復性好,可以供相關研究參考借鑒。

[1]張新寧,呂 琪,張永亮,等.大鼠心肌缺血再灌注模型建立方法的改進[J].武警醫(yī)學院學報,2008,17(11):941.

[2]Zhao ZQ,Corvera JS,Halkos ME,et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic post-conditioning during reperfusion:comparison with schemic preconditioning during[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285:H579.

[3]李 晶,鄒小華,徐向輝,等.大鼠心肌缺血后處理模型的改良及評價[J].醫(yī)學臨床研究,2008,25(12):2155.