劉偉,魯廣秀#,許予明,鄭紅

1.河南大學(xué)淮河臨床學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科,河南開封 475000;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,鄭州 450052;3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室,鄭州 450001

河南漢族人群血小板膜糖蛋白IaC807 T基因
多態(tài)性及其對血小板聚集功能的影響

劉偉1,魯廣秀1#,許予明2,鄭紅3

1.河南大學(xué)淮河臨床學(xué)院神經(jīng)內(nèi)科,河南開封 475000;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,鄭州 450052;3.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室,鄭州 450001

目的:探討河南漢族人群血小板膜糖蛋白(GP)IaC807T基因多態(tài)性及其對血小板聚集功能的影響。方法:120例河南漢族腦梗死患者為缺血組,113例健康體檢者為對照組,PCR-RELP法檢測2組GPIaC807T基因多態(tài)性,體外膠原誘導(dǎo)法檢測2組血小板聚集功能。結(jié)果:河南漢族人群GPIa基因第807位存在2種等位基因(C和T)和3種基因型(C/C、C/T、T/T);缺血組 T807等位基因頻率高于對照組(P＜0.05);GPIaT等位基因攜帶者較C等位基因攜帶者體外膠原誘導(dǎo)下血小板達30%聚集前的延遲期縮短(P＜0.05);缺血組T基因攜帶者血小板達30%聚集率前的延遲期較對照組縮短(P＜0.05);血小板最大聚集率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:血小板膜GPI-aT807等位基因可能是河南漢族腦梗死患者的遺傳危險因素,作用機制可能與血小板聚集功能的迅速啟動有關(guān)。

糖蛋白;基因多態(tài)性;缺血性腦血管病;河南;漢族

#【通訊作者】魯廣秀,Tel:86-378-3155122,E-mail:lugx820@yahoo.com.cn。

血小板聚集和粘附功能異常在缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。血小板膜糖蛋白(glycop rotein,GP)Ia-IIa是血小板膠原受體,屬整合素家族,由α和β亞單位組成,亦稱α2β1整合素。GPIa-IIa在血小板活化和血栓形成過程中起關(guān)鍵作用[1,2],血小板通過GPIa-IIa粘附到血管內(nèi)皮下暴露的膠原上,隨之被活化。近年在GPIa基因轉(zhuǎn)錄區(qū)807(C或T)和873(G或A)位點發(fā)現(xiàn)2種基因多態(tài)性,且807T和873A完全連鎖[3],該位點基因多態(tài)性和GPIa-IIa在血小板表面的表達水平相關(guān)[4],T807等位基因攜帶者具有血栓性疾病傾向。本研究觀察河南漢族腦缺血或健康人群GPIa基因807C/T多態(tài)性及其與血小板聚集功能的關(guān)系,以探討該基因多態(tài)性與ICVD的關(guān)系及可能的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年3月～2009年2月在河南省二級甲等以上醫(yī)院門診就診或住院的ICVD患者120例為缺血組,均符合2006年WHO確定的腦卒中診斷標準,經(jīng)CT或MRI證實,并排除心肌梗死及肝腎功能不良者,男73例,女47例;年齡38～75歲,平均(58.3±17.6)歲。另選擇河南省二級甲等以上醫(yī)院門診健康體檢者113例為對照組,男61例,女52例;年齡39～ 74歲,平均(58.2±16.8)歲。2組受試者均為河南漢族人,一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 GPIaC807T基因多態(tài)性檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polym erase chain reactionrestricition-fragm ent length polyMorphism,PCR-RELP)法檢測。目的片斷約184 bp,上游引物為:5'-GTGTTTAACTTGAACACA TAT-3',下游引物為:5'-ACCTTGCATATTGAATTGCTT-3'。PCR反應(yīng)體系為25μL:2×Taq M aster M ix(含0.1 U Taq DNA聚合酶,20 mM T ris-HCL,100 mMKCL,3mM MgCL2,500μM dNTP)8μL,上下游引物分別為2μL(10mm ol/L),DNA模板2μL,加雙蒸水至25μL。PCR擴增條件:95 ℃預(yù)變性5min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 m in,共35個循環(huán);72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物10μL,行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,紫外線燈下觀察擴增結(jié)果。酶切反應(yīng)體系20μL:PCR擴增產(chǎn)物10μL,TaqI內(nèi)切酶5 U,雙蒸水 8μL。65℃水浴90min,酶切產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳,紫外凝膠成像儀下觀察并照相,通過PCR條帶判斷PCR酶切產(chǎn)物的長度。

1.2.2 體外膠原誘導(dǎo)血小板聚集功能試驗 所有受試者均清晨空腹肘靜脈采血10 m L,取3 m L置于抗凝管(含0.5m L 0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝液)中。采血后30 min內(nèi)1000 r/min離心10m in,取上層液為富血小板血漿(platelet-rich p lasma,PRP);剩余血液3000 r/min離心15m in,取上層液為貧血小板血漿(p latelet-poor p lasma,PPP)。將PRP計數(shù),用PPP調(diào)節(jié)為25萬/μL。血小板聚集采用 Born比濁法測定,I型膠原的終濃度為200μg/m L。計算血小板達30%聚集率前的延遲期及血小板最大聚集率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以(x±s)表示,采用t檢驗,計數(shù)資料間比較用 χ2檢驗,多態(tài)性群體調(diào)查作 Hardy-Weinberg檢驗,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GPIaC807T基因多態(tài)性檢測結(jié)果 PCR擴增片段大小為184 bp,見圖1。酶切結(jié)果顯示,GPIa基因型有3種:①TT型:產(chǎn)物長度為 115 bp;②CC型:產(chǎn)物長度為92 bp;③CT型:產(chǎn)物長度為115 bp及92 bp;見圖2。

2.2 GPIaC807T等位基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果 缺血組及對照組的基因型分布頻率均符合H ardy-Weinberg平衡,χ2值分別為3.85及0.5292,具有群體代表性,見表1。

表1 缺血組及對照組GPIaC807T基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢驗(例)

2.3 缺血組與對照組GPIaC807T基因型及等位基因頻率 缺血組GPIa基因T等位基因頻率高于對照組(χ2=6.322,P＜0.05),見表2。

2.4 缺血組與對照組GPIa基因多態(tài)性與血小板聚集功能的關(guān)系 2組T等位基因攜帶者(TC及TT基因型)血小板達30%聚集前的延遲期較非 T基因攜帶者(CC基因型)縮短(P＜0.05),最大血小板聚集率差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與對照組比,缺血組T基因攜帶者血小板達30%聚集率前的延遲期縮短(P＜0.05),血小板最大聚集率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 缺血組與對照組GPIaC807 T基因型及等位基因頻率比較

表3 缺血組與對照組GPIa基因多態(tài)性與血小板聚集功能的關(guān)系(x-±s)

3 討論

GPIa-IIa為血小板膜上重要的膠原受體,可介導(dǎo)血小板粘附于Ⅰ-Ⅷ型膠原。人類動脈粥樣硬化斑塊主要包含I、III型膠原,I型膠原約占膠原總量的2/3。膠原可誘導(dǎo)血小板內(nèi)側(cè)磷脂層轉(zhuǎn)移至膜表面,加快凝血酶生成,后者可刺激血小板促磷脂酶暴露,形成正反饋。在1500/s的高血流切變率下,血小板對I型膠原的粘附率在一定時間范圍內(nèi)(3m in)與GPIa-IIa分子水平成正比,可能與GPIa基因核苷酸807(C/T)位點多態(tài)性有關(guān)。多態(tài)性不改變GPIa氨基酸順序,但與血小板GPIa-IIa表達水平顯著相關(guān)[6,7]。Kunicki等[5]發(fā)現(xiàn)血小板膜GPIa-IIa的密度在健康個體間可相差4倍左右,其可能是血栓性疾病的危險因素。攜帶T807等位基因的個體,血小板表達高水平GPIa-IIa,攜帶C807等位基因的個體,血小板表達低水平GPIa-IIa。高水平的GPIa-IIa表達僅依賴于T807等位基因的存在,純合子TT與雜合子CT表達相似數(shù)量的GPIa-IIa。因此,GPIa基因多態(tài)性可影響血小板的聚集功能[7]。

本研究缺血組GPIaT等位基因頻率高于對照組;體外膠原誘導(dǎo)血小板聚集試驗中,缺血組和對照組T等位基因(TC及TT基因型)攜帶者血小板達30%聚集前的延遲期均較非T基因攜帶者(CC基因型)縮短(P＜0.05),但二者的最大血小板聚集率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這與K ritzik等[6]觀察結(jié)果一致,推測可能因CC基因型者血小板表面GPIa-IIa分子密度較低,僅能粘附于少量膠原,啟動血小板聚集較慢(延遲期延長),但隨著GP活化,引起血小板釋放多種活性物質(zhì),如血栓素B2、二磷酸腺苷、血小板活化因子等,放大血小板對膠原的反應(yīng),導(dǎo)致最大血小板聚集率無顯著性差異?；诒狙芯拷Y(jié)果,推測T等位基因攜帶者,因血小板表達高密度GPIa-IIa分子,迅速粘附于大量膠原,啟動血小板聚集,釋放多種活性物質(zhì),促進凝血酶生成,而機體各種代償性抗栓機制相對滯后,如內(nèi)皮細胞釋放內(nèi)皮源性舒張因子、前列環(huán)素、組織纖溶酶原激活物及抗凝血酶-III等,引起血小板活化和血栓形成[8]。

基因多態(tài)性研究受種族、地區(qū)、樣本量及研究方法的影響,國內(nèi)外關(guān)于GPIa C807T基因多態(tài)性是否為腦梗死獨立危險因子仍存在爭議。本研究提供河南漢族人群GPIaC807 T等位基因與腦梗死的關(guān)系,推測T等位基因可能是河南漢族腦梗死患者遺傳危險因素,機制可能與血小板聚集功能迅速啟動有關(guān),但研究例數(shù)相對較少,確定結(jié)論仍需大規(guī)模前瞻性研究證實。

致謝 本實驗在鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室完成。

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Polymorphism of PlateletG lycoprotein IaC807TGene in Han Population of Henan Provinceand Its Ef fecton Platelet Ag-

gregation

LIU Wei▲,LU Guang-xiu,XU Yu-m ing,ZHENG Hong.▲Department of Neurolog y,HuaiHe Clinica l Hospita l A f filiated to Henan University,H enan 475000,China

Objective:To investigate the polymorphism of the plateletglycoprotein IaC807T gene in H an poplulation of Henan province and its effect on p late let aggregation.Methods:Platelet glycop rotein IaC807T gene polymorphism in 120 patients with cerebral in farc tion(cerebral in farction group)and 113 hea lthy vo lunteers(control group)from Han population of Henan p rovince have been detected using PCR-RFLP technique.The technique of co llagen type I-inducing p latelet aggregation was used to detec t the p latelet aggregation of tw o groups.Resu lts:There w ere two alleles(C and T)and 3 genotypes(C/CC/T T/T).The frequency ofGPIa T allele was significantly higher in the cerebra l in farction group than that in the control group(P＜0.05).The lag time before 30%p latelet aggregation w as significantly shorter in the sub jects with T allele than those with C allele in two groups(P＜0.05)and the lag time before 30%platelet aggregation of subjects with T allele in cerebral infarction group w as significantly shorter than those in the contro ls.How ever,there w as no significant difference of the maximal rate of platelet aggregation between them.Conclusion:The p latelet collagen receptorGPIaT807 allelem ight be a risk factor for cerebral infarction in patients in Henan province and the rapid initiation of co llagen-induced p late let aggregation may be one of themechanisms.

glycoprotein;genetic polymorphsim;ischemic cerebrovascular diseasese;Henan province;Han popu lation.

R741;R741.02

A

1001-117X(2010)01-0035-03

10.3870/sjsscj.2010.01.012

2009-11-21