王 麗 爽，張 宗 申，鄭 來(lái) 久

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034;2.大連工業(yè)大學(xué) 紡織輕工學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

紅麻(HibiscuscannabinusL.)是錦葵科木槿屬一年生纖維植物，其優(yōu)點(diǎn)是生長(zhǎng)周期短，植株高大粗壯，干物質(zhì)積累快，單位面積的生物學(xué)產(chǎn)量大(為樹(shù)木的3～4倍)，具有耐旱、耐貧瘠、耐鹽堿、易栽培、纖維產(chǎn)量高等特性，廣泛應(yīng)用于麻紡、造紙、建材、麻塑、吸污、飼料、食用等領(lǐng)域[1]。紅麻綜合利用潛在市場(chǎng)巨大，被發(fā)達(dá)國(guó)家視為21世紀(jì)優(yōu)勢(shì)作物。近10年來(lái)，盡管我國(guó)育成的紅麻新品種數(shù)量較多，但大部分新品種的經(jīng)濟(jì)壽命只有4～6 年，限制了種植面積的擴(kuò)大；另外，紅麻為異花授粉作物，異交率低，很難利用傳統(tǒng)的育種方法在短時(shí)間內(nèi)得到優(yōu)良種質(zhì)資源。因此，利用現(xiàn)代生物技術(shù)對(duì)紅麻種質(zhì)擴(kuò)增、改良和創(chuàng)新，以解決目前紅麻育種與生產(chǎn)中的急迫問(wèn)題具有重要意義[2]。

原生質(zhì)體融合是轉(zhuǎn)移基因組、獲得遺傳重組的一種新方法，也是實(shí)現(xiàn)胞質(zhì)基因重組的途徑，可以克服傳統(tǒng)育種技術(shù)的周期長(zhǎng)、遠(yuǎn)緣不親和等缺點(diǎn)[3]。分離高質(zhì)量原生質(zhì)體是進(jìn)行原生質(zhì)體融合的前提，而原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力在很大程度上取決于材料來(lái)源、水解酶組合、酶解時(shí)間等因素[4-5]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)植物紅麻原生質(zhì)體的制備、純化及融合的研究很少。本文對(duì)影響紅麻原生質(zhì)體產(chǎn)量、活力的因素進(jìn)行了初步探討，旨在確定紅麻原生質(zhì)體分離的適宜條件，為進(jìn)一步利用細(xì)胞融合技術(shù)改良紅麻種質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 愈傷組織誘導(dǎo)與培養(yǎng)

選取子粒飽滿的紅麻種子，在75%的酒精中消毒30 s后，用0.1%的升汞處理15～20 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，然后接種于1 mg/L 2，4-D的MS固體培養(yǎng)基上[6]，25 ℃黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織。誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)入0.5 mol/L 2，4-D+0.1 mol/L 6-BA+40 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂的MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，用作原生質(zhì)分離的材料。

1.2 原生質(zhì)體的分離、純化

參考文獻(xiàn)[7]方法，略有改動(dòng)。取繼代12 d質(zhì)地疏松的白色愈傷組織，用CPW-13M (組成為130 g/L甘露醇，1.48 g/L CaCl2·2H2O，5 mmol/L MES等，pH 5.8) 處理0.5 h，使植物細(xì)胞發(fā)生輕微質(zhì)壁分離，再投入一定含量的纖維素酶Cellulase R-10 (Japan) 和果膠酶Pectolase Y-23 (Japan)的酶液中(均用CPW-9M甘露醇溶液配制，pH 5.8，見(jiàn)表1、2)，置于50 r/min的水平搖床上，在(28±1) ℃黑暗條件下酶解。以原生質(zhì)體的產(chǎn)量和細(xì)胞碎片為指標(biāo)，篩選最佳的酶解條件。將分離后的原生質(zhì)體用50 μm(300目)孔徑的絲網(wǎng)過(guò)濾，濾液在500 r/min離心5 min，棄上清液。原生質(zhì)體懸浮于CPW-9M洗滌液中，用21%蔗糖(pH 5.8)溶液離心(500 r/min，5 min)漂浮純化原生質(zhì)體。漂浮的原生質(zhì)體吸至新管中，用CPW-9M洗滌液洗滌1次，再用原生質(zhì)體培養(yǎng)液(MS+0.6 mol/L甘露醇+ 0.5 mg/L 2，4-D，pH 5.8)洗滌1次，即可獲得純化的紅麻原生質(zhì)體。

1.3 原生質(zhì)體活力測(cè)定

采用熒光素二醋酸酯(FDA)染色法測(cè)定原生質(zhì)體的活力。取“1.2”制備的原生質(zhì)體懸浮液0.5 mL，置于1 mL的小試管中，加入FDA溶液使其最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%，混勻，室溫孵育5 min，然后在熒光顯微鏡(Motic AE31，中國(guó)廈門)下觀察、計(jì)數(shù)。以原生質(zhì)體存活率代表原生質(zhì)體活力，按式(1)計(jì)算原生質(zhì)體存活率。每個(gè)樣品重復(fù)觀測(cè)3次，最后取其均值。

原生質(zhì)體活力(%)=(存活的原生質(zhì)體數(shù)÷原生質(zhì)體總數(shù))×100%

(1)

1.4 原生質(zhì)體產(chǎn)量測(cè)定

將“1.2”收集得到的原生質(zhì)體稀釋2～5倍后，用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)[8]。按式(2)、(3)計(jì)算原生質(zhì)體密度和原生質(zhì)體產(chǎn)量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

原生質(zhì)體密度(個(gè)/mL)=(5大格內(nèi)原生質(zhì)體總數(shù)/5)×104×稀釋倍數(shù)

(2)

原生質(zhì)體產(chǎn)量(個(gè)/g)=[原生質(zhì)體密度(個(gè)/mL)×稀釋后體積(mL)]÷細(xì)胞總質(zhì)量(g)

(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 酶液組合對(duì)原生質(zhì)體分離效果的影響

將在培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)12 d，白色、組織疏松的紅麻愈傷組織分別置于表1所示的(1)～(6)水解酶液中。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1%、2%和3%的纖維素酶液中，以2%纖維素酶的水解效果最好，得到的原生質(zhì)體比較完整、產(chǎn)量較多。在2%纖維素酶的基礎(chǔ)上添加果膠酶，從表中可以看出兩種酶共同作用更有利于紅麻原生質(zhì)體的分離，其中以2%纖維素酶+1.0 %果膠酶組合的水解效果為好。在上述組合的基礎(chǔ)上添加1.0 %半纖維素酶，原生質(zhì)體的產(chǎn)量有所降低，并有少數(shù)的原生質(zhì)體破碎。因此，在后面的實(shí)驗(yàn)中，采用纖維素酶+果膠酶的組合來(lái)制備紅麻的原生質(zhì)體。

表1 水解酶組合對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

Tab.1 Effects of combination of lytic enzymes on isolation of protoplasts

酶液原生質(zhì)體產(chǎn)量原生質(zhì)體狀態(tài)(1)1%纖維素酶(2)2%纖維素酶(3)3%纖維素酶(4)2%纖維素酶+0.5%果膠酶(5)2%纖維素酶+1.0%果膠酶(6)2%纖維素酶+1.0%果膠酶+1.0%半纖維素酶++++++++++++++++完整完整較多破碎完整基本完整少數(shù)破碎注:“+”表示原生質(zhì)體少,“++”表示較多,“+++”表示非常多,“++++”表示極多。

2.2 酶濃度對(duì)原生質(zhì)體分離效果的影響

在確定了酶液組合的基礎(chǔ)上，采用不同濃度的纖維素酶和果膠酶組合酶解紅麻愈傷組織，其游離原生質(zhì)體的產(chǎn)量明顯不同(表2)。原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著纖維素酶濃度的提高而增加，但細(xì)胞碎片也相應(yīng)增多；當(dāng)纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到3.0%時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量下降，細(xì)胞碎片明顯增多。在相同的纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，1.0%的果膠酶明顯高于0.5%的果膠酶。綜合考慮，水解紅麻細(xì)胞壁的最佳水解酶組合為2.0%纖維素酶+1.0%果膠酶。

表2 酶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

Tab.2 Effects of enzyme concentration on isolation of protoplasts

編號(hào)w(纖維素酶)/%w(果膠酶)/%原生質(zhì)體產(chǎn)量/(105個(gè)·g-1)細(xì)胞碎片10.50.53.74很少21.00.54.32很少32.00.54.90少42.01.05.51少53.00.54.20多63.01.03.90較多

2.3 酶解時(shí)間對(duì)分離原生質(zhì)體的影響

在2%纖維素酶和1%果膠酶組成的酶解溶液中，將紅麻愈傷組織經(jīng)過(guò)3、4、5、6、7和8 h等不同時(shí)間的酶解處理，然后觀察原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力。由表3可知，隨著酶解時(shí)間的增加，原生質(zhì)體產(chǎn)量先增加后降低；當(dāng)酶解6 h時(shí)，能夠釋放大量原生質(zhì)體，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高；超過(guò)6 h后，懸浮液中原生質(zhì)體破裂加速，細(xì)胞碎片顯著增加。在原生質(zhì)體活力方面，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)降低其活力，酶解3～6 h所得到的原生質(zhì)體活力下降速度較慢，超過(guò)6 h則顯著下降。綜合考慮酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力的影響，認(rèn)為在此試驗(yàn)條件下水解6 h是制備大量紅麻原生質(zhì)體的最佳時(shí)間，其產(chǎn)量為5.51×105個(gè)/g，活力為63.6%(圖1)。

表3 不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體分離的影響

Tab.3 Effects of different enzymolysis time on isolation of protoplasts

t(酶解)/h原生質(zhì)體產(chǎn)量/(105個(gè)·g-1)原生質(zhì)體活力/%30.8975.342.6773.153.8669.765.5163.673.6746.981.2135.8

圖1 紅麻愈傷組織經(jīng)過(guò)酶解6 h獲得的原生質(zhì)體

2.4 pH值對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

不同pH值的水解酶液對(duì)紅麻愈傷組織制備高活力原生質(zhì)體的影響很大。當(dāng)pH值為5.8時(shí)，產(chǎn)量最高，細(xì)胞碎片很少；pH值高于或低于5.8時(shí)，制備的原生質(zhì)體數(shù)量和活性均有下降；當(dāng)pH小于5.0時(shí)，很難分離出完整的原生質(zhì)體；pH升至6.4以上，由于pH值過(guò)高導(dǎo)致酶活性降低，雖然細(xì)胞碎片較少但產(chǎn)量很低。因此pH值為5.8是分離紅麻愈傷組織原生質(zhì)體最適pH值(圖2)。

圖2 酶解液pH對(duì)紅麻原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

Fig.2 Effects of digesting solution pH on the yield of protoplasts isolated fromHibiscuscannabinusL.

2.5 不同甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

植物細(xì)胞除去細(xì)胞壁后，如果酶液中的滲透壓和細(xì)胞內(nèi)的滲透壓不平衡，會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體漲破或收縮。因此，在配制水解酶液、洗液和培養(yǎng)液中，加入一定濃度的滲透壓穩(wěn)定劑，使胞外滲透壓大致與原生質(zhì)體內(nèi)的滲透壓相同或相近。廣泛使用的滲透壓調(diào)節(jié)劑有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖或麥芽糖，其濃度在0.4～0.6 mol/L，都具有相似的穩(wěn)定滲透壓的作用。另外，在上述溶液中加入CaCl2、KH2PO4、MES、葡聚糖硫酸鉀等物質(zhì)有助于提高原生質(zhì)膜的穩(wěn)定性。

本研究選擇甘露醇作為滲透壓穩(wěn)定劑。結(jié)果表明，當(dāng)甘露醇濃度為0.55 mol/L時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量最高，并且獲得的原生質(zhì)體形狀、大小基本一致，邊緣清晰，內(nèi)含物多，細(xì)胞碎片少。高于或低于這一濃度原生質(zhì)體產(chǎn)量均有所下降，故甘露醇濃度為0.55 mol/L時(shí)制備紅麻愈傷組織原生質(zhì)體較適宜(圖3)。

圖3 甘露醇濃度對(duì)紅麻原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響

Fig.3 Effects of mannitol concentration on the yield of protoplasts isolated fromHibiscuscannabinusL.

3 結(jié) 論

水解酶組合是影響紅麻原生質(zhì)體分離效果的最直接因素；采用繼代5～10 d的紅麻愈傷組織，在pH 5.8的2.0%纖維素酶+1.0%果膠酶+0.55 mol/L甘露醇的混合水解酶液中水解6 h，得到高產(chǎn)量(5.51×105個(gè)/g)和高活力(63.6%)的原生質(zhì)體，達(dá)到了原生質(zhì)體培養(yǎng)和細(xì)胞融合的密度標(biāo)準(zhǔn)。

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