張君勝,解曉鵬,楊曉志,張 力

(江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術學院,江蘇泰州 225300)

一種簡單準確的L-蘇氨酸測定方法

張君勝,解曉鵬,楊曉志,張 力＊

(江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術學院,江蘇泰州 225300)

通過研究建立了發(fā)酵液中L-蘇氨酸定性和定量測定的“紙層析-Rf值法”和“紙層析-色斑洗脫比色法”,并對該方法的應用條件進行了研究。研究結果表明,該法對測定L-蘇氨酸含量具有較高的準確度和精密度。而且該法操作簡單、易于掌握,非常適合在L-蘇氨酸產(chǎn)生菌篩選中應用。

L-蘇氨酸;紙層析法;測定

蘇氨酸(Threonine)是人體和動物的必需氨基酸,在人和動物的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用,被廣泛應用于飼養(yǎng)業(yè)、食品業(yè)以及醫(yī)療業(yè)等方面,目前工業(yè)化生產(chǎn)L-蘇氨酸主要采用直接發(fā)酵法[1]。在L-蘇氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)中,建立一種快速高效的氨基酸測定方法對于菌種選育和發(fā)酵控制優(yōu)化是至關重要的。用氨基酸分析儀、高效液相色譜儀等可以準確測定L-蘇氨酸和蘇氨酸含量,但是成本昂貴,但由于在菌種選育及發(fā)酵條件優(yōu)化的實驗研究中需要測定的樣品多、工作量大和受設備條件限制,因而非常需要建立更切合實際、比較簡單快速的定性定量分析方法。據(jù)文獻報道[2-3],用紙層析法分離測定發(fā)酵液中的氨基酸,簡單易行,不需要氨基酸分析儀等大型儀器,準確率高,但沒人用此方法做過蘇氨酸的檢測。本研究對紙層析法-分光光度法測定發(fā)酵液中L-蘇氨酸進行了系統(tǒng)地研究,這對于L-蘇氨酸產(chǎn)生菌的篩選具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 層析展開液(正丁醇∶冰乙酸∶水=12∶3∶5,體積比);顯色液(0.5%茚三酮溶液:稱取0.5 g茚三酮用丙酮定容到100 mL);洗脫液(0.1%CuSO4∶75%乙醇=2∶38,體積比);L-蘇氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-谷氨酰胺標準液(準確稱取一定量氨基酸溶于一定量的蒸餾水中,水浴加熱溶解,配成不同濃度的標準液)。

1.1.2 主要儀器 水域恒溫振蕩器,江蘇金壇金城國勝試驗儀器廠;722分光光度計,上海分析儀器廠;800B離心機,上海安亭科學儀器廠;電子分析天平(精度0.001 g),上海天平儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液預處理 吸取0.5 mL發(fā)酵液于1.5 mL小離心管中,高速離心沉淀固形物,上清液置于4℃冰箱中待測。根據(jù)發(fā)酵液中L-蘇氨酸濃度確定樣品稀釋倍數(shù)。

1.2.2 發(fā)酵液的點樣和層析 裁取30 cm長、22 cm寬的新華3號濾紙,注意使濾紙的纖維方向與短邊一致。在距濾紙長邊邊線2 cm處用鉛筆畫一直線,每隔2 cm設一點樣點標記。將氨基酸標準液或己處理好的待測樣品,對應點在濾紙的相應點樣點上,自然晾干或用電吹風吹干。每次點樣量為1μL,可多次點樣,點樣直徑控制在4 mm內(nèi)。將點好樣的濾紙卷成圓筒狀,縫好后置于裝有約5 mm深的展開劑的層析缸內(nèi),平衡1 h后放下濾紙,讓展開劑前沿上行至距離濾紙頂端2 cm時取出濾紙,置于通風櫥內(nèi)風干。用喉頭噴霧器將層析區(qū)均勻噴上顯色劑,于105℃恒溫干燥箱內(nèi)顯色10 min。

1.2.3 發(fā)酵液“紙層析-氨基酸Rf法”定性測定L-蘇氨酸 溶質(zhì)在層析紙上移動的速度用比移值Rf,Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離[4]。發(fā)酵液樣品經(jīng)紙層析分離、顯色后,由于不同氨基酸色斑的Rf值不同和不同氨基酸與吲哚醌呈色不同,因此,可依據(jù)Rf值大小和色斑呈色定性:樣品L-蘇氨酸色斑與標準L-蘇氨酸色斑的Rf值大小一致,和吲哚醌反應呈桔黃色確定發(fā)酵液中是否含蘇氨酸[5]。

1.2.4 以“紙層析-色斑洗脫比色法”定量測定L-蘇氨酸[6-7]在濾紙完全顯色后,以相同面積剪下整個L-蘇氨酸顯色斑點,然后剪成細條狀放于試管中,加入洗脫液7 mL,加蓋振蕩洗脫30 min迅速取出在波長508 nm下測定吸光度。以不同濃度L-蘇氨酸標準液顯色斑點對應的吸光度為縱坐標,L-蘇氨酸含量為橫坐標,繪制L-蘇氨酸測定標準曲線。由標準曲線的直線回歸方程推導出發(fā)酵液中L-蘇氨酸含量計算公式。每次測定時,剪下與樣品斑點面積相當?shù)臒o色斑點的濾紙作空白對照。根據(jù)標準曲線即可計算出發(fā)酵液中的L-蘇氨酸含量。

2 結果和討論

2.1 展開劑的選擇

依據(jù)24種氨基酸的Rf值和吲哚醌顯色可以分離發(fā)酵液中的氨基酸,但幾種氨基酸Rf值相差小于0.1時,色斑容易重疊影響氨基酸的分離,故需在定性定量測定時把文獻[5]和文獻[8]中蘇氨酸Rf相近的谷氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺3種氨基酸分離。依據(jù)相秉仁、安登魁等[9]的《22種氨基酸的紙層析溶劑系統(tǒng)最佳組合選取方法的研究》和羅治權[10]的《14種氨基酸紙層析系統(tǒng)的最佳選取》選擇展開劑體系為正丁醇∶冰乙酸∶水。4種氨基酸配制的標準液和此4種氨基酸的混合液分別點樣,分別用展開劑體系為不同比例的正丁醇∶冰乙酸∶水進行考察層析劑對L-蘇氨酸測定的影響。從表1可以看出,展開劑為正丁醇∶冰乙酸∶水=12∶3∶5時,上述4種氨基酸分離效果最好,斑點之間的Rf值差距較大,而且發(fā)現(xiàn)各氨基酸的層析斑點沒有脫尾現(xiàn)象,呈圓形斑點,便于定量測定。

表1 L-蘇氨酸在各種層析溶劑中展開結果比較Table 1 The deployment result of L-threonine in solvent systems

2.2 測定顯色劑的選擇

茚三酮、吲哚醌均為較常用的氨基酸顯色劑。L-蘇氨酸發(fā)酵液樣品經(jīng)紙層析分離后,分別用茚三酮、吲哚醌來顯色(吲哚醌顯色后需褪出底色),顯色情況見表2。

表2 不同顯色劑與L-蘇氨酸的顯色情況Table 2 Color development of L-threonine with different color

由表2結果可知,吲哚醌對L-蘇氨酸顯色的最低含量比茚三酮高,即茚三酮具有更高的靈敏度。采用茚三酮顯色可以檢出發(fā)酵液樣品中微量的L-蘇氨酸,有利于L-蘇氨酸生產(chǎn)菌的篩選,同時,在實驗過程中還發(fā)現(xiàn),用吲哚醌顯色、褪色后的濾紙表面有一層白色結晶物。而且濾紙很脆,色斑也不能被洗脫進行定量分析。因此,選用茚三酮作為定量測定L-蘇氨酸的顯色劑比較合適。

2.3 最佳吸收波長的確定

顯色后的色斑用剪紙洗脫法進行定量分析時,是否選用合適的吸收波長對測定準確性影響很大。點樣分別為10 g/L和5 g/L的L-蘇氨酸標準液0.4μL,洗脫后選用不同的吸收波長測定其吸光度的變化情況,結果見圖1。由圖1可知,隨著吸收波長的變化,點樣10 g/L和5 g/L的L-蘇氨酸標準液,有相同變化規(guī)律,在光密度為508 nm時有最大吸光度,所以測定時選用吸收波長在508 nm較為合適。

圖1 吸收波長與吸光度關系Fig.1 Relationship between absorbency and absorb wavelength

2.4 顏色穩(wěn)定性測定

將點樣分別為10 g/L和5 g/L的L-蘇氨酸標準液0.4μL的顯色斑點的洗脫液,于30℃放置不同的時間,測定洗脫液的吸光度(OD508nm),結果見圖2。由圖2可知,色斑洗脫液在放置時間超過60 min后,吸光度下降。實驗還發(fā)現(xiàn),洗脫液放置24 h后不同含量的L-蘇氨酸的OD值基本相同,無法進行定量分析。在洗脫后60 min內(nèi)顏色比較穩(wěn)定。在這個時間范圍內(nèi),可以采用茚三酮比色法定量測定L-蘇氨酸含量。

2.5 吸光度與L-蘇氨酸含量關系的測定

分別點2、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200μg的L-蘇氨酸,以正丁醇∶乙酸∶水=12∶3∶5為展開劑,以5 g/L茚三酮丙酮溶液為顯色劑,于105℃顯色10 min,用洗脫液洗脫30 min后,在508 nm的波長下分別測定其吸光度,結果見圖3。由圖3可見,當濾紙點樣量大于80μg時,洗脫液的值偏低,不能準確測定蘇氨酸的量。因此,采用紙層析法定量測定蘇氨酸,濾紙上蘇氨酸含量在2～80μg時比較合適。而在濾紙上樣品溶液的點樣量為1～20μL較為適宜,這就要求樣品在采用紙層析法進行定量分析時,應選擇合適的稀釋度。

圖2 洗脫液放置時間與吸光度的關系Fig.2 Relationship between absorbency and preserving time of eluent

2.6 L-蘇氨酸標準曲線的繪制

由圖4可見,蘇氨酸含量與OD值之間形成一條密切的直線關系。采用過原點線性回歸,得到如下回歸方程:Y=0.0423X(Y表示OD值,X表示L-蘇氨酸濃度)其相關系數(shù)為R=0.9958。這說明L-蘇氨酸含量與OD值之間線性回歸比較顯著。由此可以推出發(fā)酵液中L-蘇氨酸含量計算公式:X=23.36×OD×N/V,式中:X:發(fā)酵液中L-蘇氨酸含量(g/L);OD:吸光度;N:待測樣品稀釋倍數(shù);V:點樣體積(μL)。

圖4 L-蘇氨酸測定標準曲線Fig.4 The deter mination standard curve of L-threonine

2.7 回收實驗

為了檢測方法的準確性,將不同含量L-蘇氨酸的發(fā)酵液點在濾紙上(本底量),再用標準液點量6.0μg,測定其回收率,結果見表3。如表3所示,5次測定的平均回收率101.8%,由此可見,該方法測定L-蘇氨酸含量有較好的準確度。

表3 紙層析法測定L-蘇氨酸的回收率Table 3 Recovery of L-threonine content by paper chromatography

2.8 方法的重復性試驗

對5.0μgL-蘇氨酸進行5次重復測定,測定結果見表4。

表4 重復性試驗結果Table 4 Repeatability of test results

由表4可見該方法變異系數(shù)低于1%,說明其精密度高、重復性好。由此可見本研究建立的方法,不但可以將發(fā)酵液中L-蘇氨酸和其他氨基酸分開而且還可以定量測定發(fā)酵液中蘇氨酸。

3 總 結

研究確定了定性測定發(fā)酵液中蘇氨酸鑒定分離的“紙層析—色斑顯色和Rf值”中層析液配比為正丁醇∶冰乙酸∶水=12∶3∶5,最佳顯色劑為茚三酮。確立了定量測定發(fā)酵液中L-蘇氨酸的“紙層析—色斑洗脫比色法”:每次點樣1～20μL,點樣斑點直徑控制在4 mm內(nèi);層析分離、風干后以0.5%茚三酮溶液顯色,105℃顯色10 min;以相同面積剪下整個L-蘇氨酸顯色斑點,振蕩洗脫30 min;取出后在60 min內(nèi)、波長508 nm下測定吸光度;由L-蘇氨酸測定標準曲線得出的發(fā)酵液中L-蘇氨酸含量計算公式:X=23.36×A×N/V。

本實驗表明,用紙層析—分光光度法測定發(fā)酵液中L-蘇氨酸含量具有較高的準確度和精密度,線性相關顯著,而且操作方便、易于掌握,所用儀器較簡單,適合條件一般的實驗室應用,在L-蘇氨酸產(chǎn)生菌篩選中非常適用。尤其是在菌種選育過程中,初篩時可以比較樣品L-蘇氨酸色斑與標準梯度的L-蘇氨酸色斑大小和顏色深淺,粗略估計L-蘇氨酸產(chǎn)量,簡單快捷。

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A Simple and Accurate Method to Determine of L-threonine

ZHANG Jun-sheng,Xie Xiao-peng,YANG Xiao-zhi,ZHANG Li
(Jiangsu Animal Husbandry&Veterinary College,Taizhou,Jiangsu225300)

Paper chromatograghy-Rf and chromatograghy-mottle elution chromometry was established to determine L-threonine concentration qualitatively and quantitatively in the fermentation broth.The application conditions of this method were studied.The results showed that the method was highly accurate and precise in the deter mination of L-threonine.The method was easy to operate and master,very suitable to use in screening L-threonine producing strains.

L-threonine;paper chromatograghy;deter mination

Q93-3;S816

B

1005-7021(2010)06-0097-04

張君勝 男,講師。研究方向為微生物育種與發(fā)酵。E-mail:napzjs@163.com

＊通訊作者。Tel:0523-86158368,E-mail:zhangli2118@sohu.com

2010-08-31;

2010-10-25