周文婷，李麗文，劉向宇

（1.哈爾濱體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)系，黑龍江 哈爾濱 150008；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030）

黑龍江漢族人群肌型肌酸激酶基因CKMM- NcoⅠ多態(tài)研究

周文婷1，李麗文2，劉向宇2

（1.哈爾濱體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)系，黑龍江 哈爾濱 150008；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030）

目的：研究黑龍江漢族群體CKMM基因NcoⅠ位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性分布。方法：應(yīng)用PCRRFLP法測(cè)定120名黑龍江籍漢族健康大學(xué)生CKMM基因NcoⅠ位點(diǎn)的基因型和等位基因的頻率分布。結(jié)果：等位基因頻率是A=87%, G=13%，基因型頻率為A/A=76% , A/G=22% , G/G=2%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，其基因型頻率和等位基因頻率在男女間無顯著性差異，與歐美人群相比有非常顯著性差異，而與我國(guó)北方漢族人及韓國(guó)人相比沒有差異不顯著性。

肌型肌酸激酶基因；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)

Abstract: Objectives: To study the distribution of genotype and allele frequencies of CKMM gene at NcoⅠloci in Han origin population in Heilongjiang province. Methods: PCR-RFLP was used to determine the genotypes and alleles frequencies of CKMM gene at NcoⅠloci in 120 unrelated healthy university students. Results: The allele frequencies were: A = 87%, G = 13%. The genotype frequencies were A /A = 76%, A /G = 22%, G/G = 2% and they were in Hardy-Weinberg equilibrium. No significant difference was detected in genotype and allele frequencies between men and women. There were significant differences between Han origin population in Heilongjiang province and those in Europe and America, but no significant difference was found between Heilongjiang population and Chinese population, as well as Korean population.

Key words: CKMM gene; PCR; RFLP

CLC number: G804.2 Document code: A Article ID: 1008-2808(2010)06-0001-04

肌酸激酶（CK）通常存在于動(dòng)物的心臟、肌肉以及腦等組織的細(xì)胞漿和線粒體中，是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮和ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶［1,2］，它可逆地催化肌酸（Cr）與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)，是該反應(yīng)的關(guān)鍵酶。CK與磷酸肌酸（PCr）組成肌酸-磷酸肌酸穿梭系統(tǒng)，可作為細(xì)胞內(nèi)“暫時(shí)的能量緩沖系統(tǒng)”，用以在高能量需求時(shí)維持細(xì)胞內(nèi)的ATP/ADP比率［3］；同時(shí)作為能量轉(zhuǎn)運(yùn)單位, 該系統(tǒng)也作用于將能量從產(chǎn)生部位轉(zhuǎn)運(yùn)至利用部位。CK有四種同工酶形式，分別為肌肉型(MM)、腦型(BB)、雜化型(MB)和線粒體型(MiMi)，其中CKMM主要表達(dá)于骨骼肌中，在心肌中也有少量表達(dá)。研究證實(shí)，肌肉中的CKMM主要集中在M線附近［4］，主要功能是在肌球蛋白頭部生成高濃度的ATP，為肌肉收縮及運(yùn)動(dòng)供能。此外，CKMM在肌質(zhì)網(wǎng)(SR)Ca2+ ATP酶的附近也有表達(dá)［5］，作用可能涉及Ca2+的再聚集［6］，進(jìn)而影響肌肉的工作能力。

人的CKMM基因位于染色體的19q13.2～q13.3區(qū)域，長(zhǎng)度約有17.5 kb，包含8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子。研究表明，在CKMM基因3′端非編碼區(qū)存在可能與耐力有關(guān)的CKMM-NcoⅠ多態(tài)位點(diǎn)，且該位點(diǎn)在我國(guó)北方漢族人群中的分布與歐美人群相比具有非常顯著性差異［7］，提示該位點(diǎn)可能與我國(guó)北方漢族人和歐美人體質(zhì)及耐力素質(zhì)間的顯著差異有關(guān)，對(duì)于我們認(rèn)識(shí)不同地區(qū)、不同種族間人群的體質(zhì)和運(yùn)動(dòng)能力差異具有重要意義。然而，CKMM基因NcoⅠ位點(diǎn)多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究后繼乏力，對(duì)其適用性迄今尚無更多佐證，故本研究在已有研究的基礎(chǔ)上對(duì)黑龍江籍漢族人的CKMM-NcoⅠ位點(diǎn)多態(tài)分布進(jìn)行探索，旨在為進(jìn)一步開展群體遺傳學(xué)和體育科學(xué)研究提供有益的資料。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

健康大學(xué)生120例，其中男性82人，女性38人，所有研究對(duì)象均為黑龍江籍漢族，彼此無血緣關(guān)系受試者基本情況見表1。

表1 受試者基本情況

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取靜脈血2mL, 2%EDTA抗凝，分離白細(xì)胞，-20℃保存。采用Promega公司試劑盒提取基因組DNA。PCR-RFLP法解析NcoⅠ位點(diǎn)基因型，PCR擴(kuò)增引物序列如下：

F: GGGATGCTCAGACTCACAGA；R: AACTTGAATTTAGCCCAACG

PCR反 應(yīng) 體 系 為：PCR反 應(yīng)buffer 2μL，1.5 mmol/L MgCl2，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μmol/L，上、下引物各0.5μmol/L，Taq酶1U，模板100 ng，無菌水補(bǔ)足至20μL。

PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性7 min，94 ℃變性40 s，50 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖中進(jìn)行電泳，90 V 40 min檢驗(yàn)擴(kuò)增效果。

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物7 μL、限制性內(nèi)切酶N coⅠ1μL ( 8 U)、10×緩沖液2 μL和0.1% BSA 2 μL于37 ℃酶切8 h。酶切產(chǎn)物以3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)紫外光成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以χ2檢驗(yàn)計(jì)算基因型頻率是否符合Hardy- Weinberg遺傳平衡定律。采用r ×c列聯(lián)表卡方檢驗(yàn)計(jì)算與其他人群的基因型分布差異。檢驗(yàn)顯著性水平定為P＜0. 05，非常顯著性差異定為P＜0. 01。

2 結(jié)果與分析

CKMM基因經(jīng)PCR及N coⅠ內(nèi)切酶消化以后得到3種條帶：有酶切位點(diǎn)的純合型有153 bp /206 bp 兩條帶，沒有酶切位點(diǎn)的純合型只有359 bp 1條帶，而雜合型有153 bp /206 bp + 359 bp 3條帶，其中153 bp + 206 bp /153 bp + 206 bp 是A/A純合型，359 bp /359 bp是G/G純合型，153 bp + 206 bp/359 bp是A/ G雜合型。

3種基因型分布經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P＜0. 05)，具有群體代表性。不同性別受試者在NcoⅠ位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率均無顯著性差異，與周多奇等［7］研究結(jié)果相似，表明黑龍江籍漢族人在該位點(diǎn)與所涉地域更廣的我國(guó)北方漢族人多態(tài)分布相近，具有典型的北方漢族群體遺傳特征，具體分布見表2。

表2 黑龍江地區(qū)漢族人群CKMM 基因N coⅠ位點(diǎn)多態(tài)性分布

與加拿大、西班牙和意大利人群相比，黑龍江及我國(guó)北方漢族人在該位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率與他們均有非常顯著性差異( P＜0. 01)，而與韓國(guó)人相比，基因型頻率和等位基因頻率差異均不顯著。在對(duì)其他種族間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，韓國(guó)人與各歐美人群在等位基因頻率和基因型頻率上均呈顯著性差異( P＜0.05)，而歐美各國(guó)人群組間則均無顯著性差異（表3）。

表3 不同種族人群CKMM 基因N coⅠ位點(diǎn)多態(tài)性分布

個(gè)體間體質(zhì)和運(yùn)動(dòng)能力的差異受多種因素影響，其中環(huán)境（運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練、營(yíng)養(yǎng)與技術(shù)方法）和遺傳因素在很大程度上起決定作用，而在相同的環(huán)境下，不同的遺傳背景可能是影響個(gè)體間不同體質(zhì)、不同運(yùn)動(dòng)能力的主要原因。受制于倫理學(xué)，體質(zhì)與運(yùn)動(dòng)能力的遺傳學(xué)研究較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)未能廣泛開展。隨著生物技術(shù)與分子遺傳學(xué)的發(fā)展，迄今已有包括214個(gè)常染色體基因位點(diǎn)、7個(gè)X染色體位點(diǎn)和18個(gè)mtDNA序列多態(tài)性位點(diǎn)在內(nèi)的，與人類體質(zhì)和優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)的基因位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)和定位［14］，其中有關(guān)耐力素質(zhì)的研究較多，極大豐富了人們對(duì)不同種族、不同地域人群體質(zhì)和運(yùn)動(dòng)能力差異性原因和機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也更好地促進(jìn)了群體遺傳學(xué)的發(fā)展。作為運(yùn)動(dòng)能力的重要組成部分，耐力素質(zhì)是多基因控制的復(fù)雜表型。有人研究了多個(gè)代謝基因?qū)δ土\(yùn)動(dòng)員體型、慢肌纖維比例及最大氧消耗量的綜合作用，發(fā)現(xiàn)了10個(gè)與耐力相關(guān)的基因多態(tài)型，而這些基因多態(tài)型在運(yùn)動(dòng)員中表達(dá)的數(shù)量越多，運(yùn)動(dòng)員的慢肌纖維比例越高，氧消耗量越大，耐力素質(zhì)也越好［15］。隨著高通量SNP分析技術(shù)的應(yīng)用，更快更方便的全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基因間的微小、多重、積累的相互作用將被檢測(cè)，“運(yùn)動(dòng)基因”的探尋進(jìn)程有望加快，通過分子技術(shù)進(jìn)行優(yōu)秀運(yùn)動(dòng)員選材的愿望將更快實(shí)現(xiàn)［16］。CKMM基因N coⅠ多態(tài)性是已報(bào)道的可能與耐力運(yùn)動(dòng)能力和耐力訓(xùn)練敏感性相關(guān)的多態(tài)位點(diǎn)，其中雜合型A/G攜帶者被認(rèn)為可能具有更高的耐力水平和更高的訓(xùn)練敏感性［7-11］，周多奇等［7］對(duì)我國(guó)北方漢族人耐力訓(xùn)練敏感性的研究也對(duì)此也予以了證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，黑龍江籍漢族人中A/G基因型的頻率為22%，與我國(guó)北方漢族人（24%）中該基因型頻率相似，與韓國(guó)人（31%）相比差異也不顯著（P＞0.05），但與歐美各國(guó)人相比，其分布頻率非常顯著低于各國(guó)（35%～54%）（P＜0.01）；而在韓國(guó)人中，其分布頻率也顯著低于歐美各國(guó)（P＜0.05），而歐美各國(guó)人間其分布頻率無顯著性差異（P＞0.05），表明CKMM基因N coⅠ多態(tài)性可能存在種族及地域上的顯著差異，而這或許正是亞洲地區(qū)與歐美地區(qū)人群間存在較大體質(zhì)和耐力水平差異的原因之一。當(dāng)然，由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及研究樣本量所限，很多研究都可能出現(xiàn)結(jié)論的相悖，然而隨著后基因組計(jì)劃及群體遺傳學(xué)的的深入開展，相信大量的遺傳學(xué)信息將會(huì)逐漸彌補(bǔ)這些缺憾，而本研究也將在未來進(jìn)一步加大樣本含量，以期更準(zhǔn)確地描述該基因多態(tài)位點(diǎn)的分布特征。

3 結(jié) 論

研究首次對(duì)黑龍江籍漢族人在CKMM基因NcoⅠ位點(diǎn)的多態(tài)分布進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，等位基因頻率分別為A=87%和G=13%，基因型頻率分別為A/A=76%、A/G=22%和G/G=2%，基因型和等位基因頻率在男性和女性間無顯著性差異（P＞0.05），與歐美人群相比頻率差異具有非常顯著性（P＜0.01），而與我國(guó)北方漢族人及韓國(guó)人相比差異無顯著性（P＜0.05），不僅對(duì)我國(guó)北方漢族人在CKMM基因N coⅠ位點(diǎn)的多態(tài)分布信息進(jìn)一步予以補(bǔ)充，也為后續(xù)更佳深入的群體遺傳學(xué)研究和運(yùn)動(dòng)能力的分子生物學(xué)研究提供了有用的資料。

［1］Lehninger AL． Bioenergetics［M］． 2nd． Benjamin, Menlo Park． 1977, 67-77．

［2］Seraydrarian MW & Abbot BC． The role of the creatine phosphokinase system in muscle［J］． J Mol Cell Cardiol, 1976, 8: 741-746．

［3］Saks VA, Rosenshtraukh LV, Sgmirnov VN, et al．Role of Creatine Phosphokinase in Cellular Function and Metabolism ［J］． Can J Physiol Pharmacol, 1978, 56 (5) : 691-706．

［4］Turner DC, Wallimann T, Eppenberger HM． A protein that Binds Specifically to the M-line of Skeletal Muscle is Identified as the Muscle Form of Creatine Kinase［J］． Proc Natl Acad Sci USA, 1973, 70: 702-705．

［5］Korge P, Camphcil KB． Local ATP Regeneration is Important for Sarcoplasmic Rcticulum Ca2+ Puinp Function［J］． Am J Physiol, 1994, 267 : C357-C366．

［6］Steeghs K, Oerlemans F, Haan A, et al．Cytoarchitectural and Metabolic Adaptations in Muscles with Mitochondrial and Cytosolic Creatine Kinase Deficiencies Mol Cell［J］． Biochemistry, 1998, 184: 183-194．

［7］周多奇,胡 揚(yáng),劉 剛,等．中國(guó)北方漢族人群肌型肌酸激酶基因(CKMM )A/G多態(tài)研究［J］．遺傳, 2005, 27 (4) : 535-538．

［8］Rivera MA, Dionne FT, Simoneau JA, et al． Musclespecific creatine kinase gene polymorphism and VO2max in the Heritage family study［J］． Med Sci Sports Exerc, 1997, 29 : 1311-1317．

［9］Rivera MA, Perusse L, Simoneau JA, et al． Linkage between a muscle-specific CK gene marker and VO2max in the HER ITAGE family study［J］． M ed Sci Sports Exerc, 1999, 31 : 698-701．

［10］Rivera MA, Dionne FT, Wolfarth B, et al． Musclespecific creatine kinase gene polymorphisms in elite endurance athletes and sedentary controls［J］． M ed Sci Sports Exerc, 1997, 29: 1444-1447．

［11］Lucia A, Gomez-Gallego F, Chicharro JL, et al．Is there an association between ACE and CKMM polymorphisms and cycling performance status during 3-week races［J］? Int J Sports Med, 2005, 26, 442-447．

［12］ Gennarelli M, Novelli G, Cobo A, et al． 3′creatine kinase (M-type) polymorphism linked to myotonic dystrophy in Italian and Spanish populations［J］．Hum Genet, 1991, 87 : 654-656．

［13］Byung YK, Chin YK, Kang OL． Muscle-specific creatine kinase gene polymorphisms in korean elite athletes［J］． J Toxicol Pub Health, 2003, 19 : 115-121．

［14］Bray MS, Hagberg JM, Pérusse L, et al． The Human Gene Map for Performance and Health-Related Fitness Phenotypes: The 2006-2007 Update［J］． Med Sci Sports Exerc, 2009, 41 (1) : 35-73．

［15］Ahmetov II, Williams AG, Popov DV, et al． The combined impact of metabolic gene polymorphisms on elite endurance athlete status and related phenotypes［J］． Human Genet, 2009, Aug 4．［Epub ahead of print］．

［16］Trent RJ, Yu B． The future of genetic research in exercise science and sports medicine［J］． Med Sport Sci, 2009, 54 : 187-195．

Research on Polymorphism in Muscle-speci fi c Creatine Kinase Gene at Nco?loci in Han Origin Population in Heilongjiang Province

ZHOU Wen-ting1, LI Li-wen2, LIU Xiang-yu2
(1. Sports Science of Human Body Dept. in Harbin Institute of P.E., Harbin 150008, Heilongjiang China; 2. Northeast Agriculture University, Harbin 150030, Heilongjiang China)

G804.2

A

1008-2808(2010)06-0001-04

2010-09-10；

2010-12-09

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：11531253）。

周文婷（1979－），女，講師，博士后，研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)分子生物學(xué)及低氧訓(xùn)練。