張劍俠，王 勇，王躍進(jìn)，張艷艷

（農(nóng)業(yè)部西北園藝植物種質(zhì)資源利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

生產(chǎn)上栽培的無核葡萄多為歐亞種（Vitis vinifera L.）品種，品質(zhì)優(yōu)良，但抗病性差[1]，因此培育抗病無核品種是葡萄育種的重要課題。在無核葡萄常規(guī)育種中，是以有核品種作母本、無核品種作父本進(jìn)行雜交，通常獲得無核后代的比率很低[2]。Ramming等發(fā)明的無核葡萄胚挽救育種技術(shù)，以無核葡萄作母本進(jìn)行雜交，結(jié)合離體胚培養(yǎng)，可使無核雜種比率達(dá)到82%[3]。采用該技術(shù)，美國已選育出“莫麗莎”等十幾個(gè)無核優(yōu)良株系[4]。近20年來，國內(nèi)在無核葡萄胚挽救育種上也取得了一定的研究進(jìn)展[5-7]，特別是在利用中國野生葡萄的抗病性，進(jìn)行抗病無核葡萄胚挽救育種方面，獲得了較多的胚挽救苗[7]，鑒定和篩選抗病無核雜種成為育種程序的下一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

傳統(tǒng)的育種方法是根據(jù)雜種的性狀表現(xiàn)和育種者的經(jīng)驗(yàn)，間接對基因型進(jìn)行選擇，存在花費(fèi)大、周期長、效率低的問題。分子標(biāo)記的發(fā)展為解決這一問題開辟了新的途徑，可以實(shí)現(xiàn)對基因型的直接選擇[8]。標(biāo)記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）即是根據(jù)與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記存在與否，對雜種幼苗進(jìn)行取舍，從而提高育種效率。

王躍進(jìn)等從無核白葡萄中獲得了與無核基因相連鎖的RAPD標(biāo)記UBC269-484，并依據(jù)該標(biāo)記序列，設(shè)計(jì)合成了檢測無核基因的DNA探針GSLP1，能夠在無核葡萄中擴(kuò)增出SCAR標(biāo)記GS－LP1-569，該SCAR標(biāo)記與無核主基因的連鎖距離為1.2 cM[9-11]。張劍俠等以種間雜交組合白河-35-1（抗?。良牙劊ǜ胁。┯H本及其F1代為試材，獲得了中國野生葡萄抗黑痘病基因的RAPD標(biāo)記OPS03-1354[12]，并利用OPS03-1354對該組合的F2代207株及另一組合廣西-1（抗病）×京可晶（感?。〧1代339株進(jìn)行了分子檢測，結(jié)果與田間抗病表現(xiàn)型的符合率分別為83.57%和98.52%[13]。張艷艷等以該組合的親本及其F1、F2代為試材，獲得了6個(gè)與中國野生葡萄抗霜霉病基因相連鎖的RAPD標(biāo)記，其中標(biāo)記S416-1224對F2代109株的檢測結(jié)果與田間抗病表現(xiàn)型的符合率為78.90%[14]。本研究是在獲得無核葡萄胚挽救苗的基礎(chǔ)上，利用葡萄無核基因探針GSLP1、抗黑痘病基因RAPD標(biāo)記OPS03-1354、抗霜霉病基因RAPD標(biāo)記 S416-1224，對抗病無核葡萄雜交后代進(jìn)行輔助選擇，為進(jìn)一步選育出無核葡萄新品系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 葡萄材料

為西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄種質(zhì)資源圃中保存的種間雜交、品種自交共6個(gè)組合的親本及其胚挽救后代127株（見表1、2）。

表1 親本抗黑痘病和霜霉病的表現(xiàn)及其分子標(biāo)記檢測Table1 Resistance to anthracnose and downy mildew of parents and the test results for them by molecular markers

表2 分子標(biāo)記輔助選擇無核葡萄胚挽救雜種Table2 Molecular marker-assisted selection for hybrids from embryo-rescue of grape seedless

1.1.2 分子標(biāo)記的引物序列

葡萄無核基因SCAR標(biāo)記GSLP1-569的探針（GSLP1）序列[10-11]：5′CCAGTTCGCCCGTAAATG 3′，中國野生葡萄抗黑痘病基因RAPD標(biāo)記OPS03-1354 的引物（OPS03）序列[12-13]：5′CAGAGGTCCC 3′；中國野生葡萄抗霜霉病基因RAPD標(biāo)記S416-1224 的引物（S416）序列[14]：5′GTAACCAGCC 3′。

1.1.3 主要儀器和試劑

PCR儀為PTC-100型，電泳儀為DYY-Ⅲ-8B型，凝膠成像系統(tǒng)為GENE GENIUS型，紫外分光光度計(jì)為UV-2802型。Taq DNA聚合酶（華美公司產(chǎn)品）；dNTPs（寶鑫生物公司產(chǎn)品）；引物（由上海生工公司合成）；DNAMarkerDL2000（東勝生物公司產(chǎn)品）。

1.2 方法

1.2.1 葡萄抗黑痘病、霜霉病的鑒定

參照王躍進(jìn)等對葡萄黑痘病的鑒定方法[15]，2008和2009年在田間自然條件下調(diào)查雜交親本葉片的感病百分?jǐn)?shù)（每株隨機(jī)調(diào)查100枚葉片），按0～7級分級，然后換算成感病指數(shù)（Susceptibility index，SI）。SI取2年的平均值，按照0～5級分級法，即SI=0，不感?。籗I=0.1～0.5,高抗；SI=5.1～25.0,抗病；SI=25.1～50.0，感??；SI=50.1～100，高感。每年的6月份在黑痘病的發(fā)病盛期調(diào)查黑痘病，8月份在霜霉病的發(fā)病盛期調(diào)查霜霉病，并以抗兩種病害的中國野生華東葡萄株系白河-35-1作為抗病對照（CK1），以感兩種病害的歐洲葡萄品種佳利釀作為感病對照（CK2）。

1.2.2 葡萄基因組DNA的提取

參照王躍進(jìn)等改良的CTAB法[9]。

1.2.3 PCR的反應(yīng)體系

反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 2.5 μL，MgCl2（15 mmol·L-1）1.5 μL， dNTPs（2.5 mmol·L-1） 2.0 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，引物（20 μmol·L-1）1 μL，模板 DNA 60 ng，以 ddH2O 補(bǔ)足，總體積為25 μL，加蓋25 μL礦物油。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃1 min,36℃1 min,72℃2 min，共45個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10 min，終止于4℃。PCR反應(yīng)重復(fù)2次。葡萄無核基因標(biāo)記檢測以無核品種無核白作為對照（CK3）。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的電泳分離

采用 1.4%瓊脂糖凝膠（含 0.5 μg·mL-1EB）電泳，電泳緩沖液為1×TAE，以DL2000作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，5 V·cm-1電壓電泳約1 h，用凝膠成像系統(tǒng)觀察、照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交親本對黑痘病、霜霉病的抗性表現(xiàn)

由表1可知，在9個(gè)雜交親本中，中國野生葡萄華東葡萄株系白河-35-1（抗病對照CK1）、山葡萄株系雙優(yōu)、山葡萄株系黑龍江實(shí)生、秦嶺葡萄株系平利-5、燕山葡萄株系燕山-1和歐山雜種北醇均表現(xiàn)為抗黑痘病和霜霉病，而歐洲葡萄品種佳利釀（感病對照CK2）、底來特、愛莫無核、火焰無核和地球紅均不抗兩種病害。

2.2 分子標(biāo)記對雜交親本的檢測結(jié)果

2.2.1 無核基因標(biāo)記GSLP1-569對雜交親本的檢測

用獲得葡萄無核基因SCAR標(biāo)記GSLP1-569的探針GSLP1對9個(gè)雜交親本進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果見圖1。除歐洲葡萄無核品種無核白（無核對照CK3）和火焰無核中擴(kuò)增出了569 bp的DNA標(biāo)記外，在無核品種底來特、愛莫無核及其他有核品種和株系中均未出現(xiàn)這一標(biāo)記。這說明無核基因探針GSLP1適用于無核白及與其親緣關(guān)系較近的無核品種（如火焰無核）的檢測。

圖1 無核基因探針GSLP1在親本中的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplified result of the parents using the seedless genes probe GSLP1

2.2.2 抗黑痘病基因標(biāo)記RAPD標(biāo)記OPS03-1354對雜交親本的檢測

用獲得中國野生葡萄抗黑痘病基因RAPD標(biāo)記OPS03-1354的特異引物OPS03對9個(gè)雜交親本進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。在中國野生華東葡萄白河-35-1（抗病對照CK1）、山葡萄雙優(yōu)、山葡萄黑龍江實(shí)生、燕山葡萄燕山-1、秦嶺葡萄平利-5中均存在1 354 bp的RAPD標(biāo)記，而歐洲葡萄佳利釀（感病對照CK2）、底來特、愛莫無核、火焰無核、地球紅及歐山雜種北醇中均不存在。

2.2.3 抗霜霉病基因標(biāo)記RAPD標(biāo)記S416-1224對親本的檢測

用獲得中國野生葡萄抗霜霉病基因的RAPD標(biāo)記S416-1224的特異引物S416對9個(gè)雜交親本的檢測結(jié)果見圖3。RAPD標(biāo)記S416-1224存在于華東葡萄白河-35-1（CK1）、山葡萄雙優(yōu)、山葡萄黑龍江實(shí)生和秦嶺葡萄平利-5中，而不存在于歐洲葡萄佳利釀（CK2）、底來特、愛莫無核、火焰無核、紅地球及歐山雜種北醇、燕山葡萄燕山-1中。

圖2 特異引物OPS03對親本的RAPD擴(kuò)增Fig.2 RAPD amplified result of the parents using the special primer OPS03

圖3 特異引物S416對親本的RAPD擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 RAPD amplified result of the parents using the special primer S416

2.3 分子標(biāo)記輔助選擇雜種后代

2.3.1 無核基因SCAR標(biāo)記GSLP1-569對雜種后代的檢測

由于無核基因SCAR標(biāo)記GSLP1-569僅存在于親本火焰無核中，因此對以火焰無核作親本的雜交后代進(jìn)行了檢測，結(jié)果見表2。在火焰無核自交的19株雜種中，有 11株（FZ9、FZ16、FZ19、FZ22、FZ23、FZ29、FZ38、FZ39、FZ40、FZ42、FZ52）存在無核基因標(biāo)記GSLP1-569（見圖4）。在火焰無核×黑龍江實(shí)生的12株雜種中，有7株（03-2-7、03-2-14、03-2-16、03-2-18、03-2-19、03-2-20、03-2-24）存在這一標(biāo)記（見圖5）。在火焰無核×平利-5的11株雜種中，有9株（FP1、FP7、FP8、FP9、FP15、FP16、FP17、FP18、FP19）存在這一標(biāo)記（見圖6）。

圖4 探針GSLP1對火焰無核自交后代的PCR檢測Fig.4 PCR amplified result of the progenies from Flame Seedless selfing using the probe GSLP1

圖5 探針GSLP1對火焰無核×黑龍江實(shí)生后代的PCR檢測Fig.5 PCR amplified result of the hybrids from Flame Seedless×Heilongjiang Seedling using the probe GSLP1

圖6 探針GSLP1對火焰無核×平利-5后代的PCR檢測Fig.6 PCR amplified result of the hybrids from Flame Seedless×Pingli-5 using the probe GSLP1

2.3.2 抗黑痘病基因RAPD標(biāo)記OPS03-1354對雜種后代的檢測

由于親本黑龍江實(shí)生、平利-5、雙優(yōu)、燕山-1中存在抗黑痘病基因的RAPD標(biāo)記OPS03-1354，因此對這些野生株系作親本的雜交組合后代用特異引物OPS03進(jìn)行RAPD檢測，結(jié)果見表2。在火焰無核×黑龍江實(shí)生的12株雜種中有4株（03-2-14、03-2-19、03-2-24、03-2-30）中存在這一標(biāo)記（見圖7）。在火焰無核×平利-5的11株雜種中有3株（FP5、FP13、FP17）存在這一標(biāo)記（見圖 8）。在底來特×雙優(yōu)的59株雜種中，有14株（03-1-9、03-1-14、03-1-19、03-1-24、03-1-27、03-1-35、03-1-41、03-1-44、03-1-53、03-1-60、03-1-68、03-1-79、03-2-87、03-1-95）存在這一標(biāo)記（見圖9）；在底來特×平利-5的13株雜種中有4株（DP4、DP8、DP14、DP17）存在這一標(biāo)記（見圖10）；在底來特×燕山-1的13株雜種中有3株（DY3、DY18、DY22）存在這一標(biāo)記（見圖11）。

圖7 特異引物OPS03對火焰無核×黑龍江實(shí)生后代的RAPD擴(kuò)增Fig.7 RAPD amplified result of the hybrids from Flame Seedless×Heilongjiang Seedling using the special primer OPS03

圖8 特異引物OPS03對火焰無核×平利-5后代的RAPD擴(kuò)增Fig.8 RAPD amplified result of the hybrids from Flame Seedless×Pingli-5 using the special primer OPS03

圖9 特異引物OPS03對底來特×雙優(yōu)后代的RAPD擴(kuò)增Fig.9 RAPD amplified result of the hybrids from Delight×Shuangyou using the special primer OPS03

圖10 特異引物OPS03對底來特×平利-5后代的RAPD擴(kuò)增Fig.10 RAPD amplified result of the hybrids from Delight×Pingli-5 using the special primer OPS03

圖11 特異引物OPS03對底來特×燕山-1后代的RAPD擴(kuò)增Fig.11 RAPD amplified result of the hybrids from Delight×Yanshan-1 using the special primer OPS03

2.3.3 抗霜霉病基因RAPD標(biāo)記S416-1224對雜種后代的檢測

由于親本黑龍江實(shí)生、平利-5、雙優(yōu)中存在抗霜霉病基因的RAPD標(biāo)記S416-1224，因此對這些野生株系作親本的雜交組合后代用特異引物S416進(jìn)行RAPD檢測，結(jié)果見表2。在火焰無核×黑龍江實(shí)生的12株雜種中，有1株（03-2-12）中存在這一標(biāo)記（見圖12）；在底來特×平利-5的13株雜種中，有10 株（DP1、DP4、DP5、DP6、DP8、DP15、DP17、DP18、DP21、DP22）中存在這一標(biāo)記（見圖 13）；在底來特×雙優(yōu)的59株雜種中，有8株（03-1-5、03-1-14、03-1-19、03-1-24、03-1-27、03-1-44、03-1-79、03-1-87）存在這一標(biāo)記（見圖14）；在火焰無核×平利-5的11株雜種中不存在這一標(biāo)記。

綜上所述，對6個(gè)雜交組合127株胚挽救苗的分子檢測結(jié)果表明，擁有無核基因SCAR標(biāo)記GSLP1-569的雜種有27株，其中4株雜種03-2-14、03-2-19、03-2-24（火焰無核×黑龍江實(shí)生）和FP17（火焰無核×平利-5）還同時(shí)擁有抗黑痘病基因RAPD標(biāo)記OPS03-1354。擁有抗黑痘病基因RAPD標(biāo)記OPS03-1354的雜種28株，擁有抗霜霉病基因RAPD標(biāo)記S416-1224的雜種19株，其中有10株雜種DP1、DP8、DP17（底來特×平利-5）、03-1-14、03-1-19、03-1-24、03-1-27、03-1-44、03-1-79、03-1-87（底來特×雙優(yōu)）同時(shí)擁有抗黑痘病基因和抗霜霉病基因RAPD標(biāo)記。

圖12 特異引物S416對火焰無核×黑龍江實(shí)生后代的RAPD擴(kuò)增Fig.12 RAPD amplified result of the hybrids from Flame Seedless×Heilongjiang Seedling using the special primer S416

圖13 特異引物S416對底來特×平利-5后代的RAPD擴(kuò)增Fig.13 RAPD amplified result of the hybrids from Delight×Pingli-5 using the special primer S416

圖14 特異引物S416對底來特×雙優(yōu)后代的RAPD擴(kuò)增結(jié)果Fig.14 RAPD amplified result of the hybrids from Delight×Shuangyou using the special primer S416

3 討論

葡萄黑痘病（Sphacerlouna ampelinum）和霜霉?。≒lasmopara viticola）是葡萄上的兩種重要真菌病害，發(fā)病條件有較大的相似性，均是高濕和適宜的溫度下（18～25℃）容易發(fā)生和流行，特別是能對歐洲葡萄造成嚴(yán)重的危害[15-18]。因此，除了無核性狀，抗病性也是葡萄育種的重要目標(biāo)之一，培育抗病無核葡萄品種是生產(chǎn)發(fā)展的迫切需要。中國野生葡萄資源豐富，其中的一些種和株系抗病性極強(qiáng)[15-17]，利用中國野生葡萄的抗病性與歐洲葡萄無核品種雜交是培育抗病無核葡萄品種的一個(gè)有效策略。而利用與無核性狀相連鎖的基因標(biāo)記和與抗病性狀相連鎖的基因標(biāo)記對雜種后代進(jìn)行輔助選擇，將會節(jié)省人力、物力和財(cái)力，提高育種效率，縮短育種周期。Striem等應(yīng)用RAPD標(biāo)記對早玫瑰（Early Muscat）×火焰無核（Flame Seedless）F1代的無核亞性狀進(jìn)行早期MAS，可以淘汰約44%的有核雜種[19]。Scott等利用AFLP技術(shù)對火焰無核的突變體進(jìn)行了早期鑒定[20]。王躍進(jìn)等利用葡萄無核基因DNA探針對我國栽培的無核葡萄品種進(jìn)行了檢測，并初步應(yīng)用于輔助育種[21]。Kim等獲得了葡萄抗黑痘病基因的RAPD標(biāo)記OPB15-1247，進(jìn)一步發(fā)展成為SCAR標(biāo)記，應(yīng)用于黑痘病抗性基因型的基因位點(diǎn)檢測[22]。Riaz等利用來自峽谷葡萄b43-17抗皮爾斯病基因的微衛(wèi)星標(biāo)記VVIP26、ctg1026876和VMC2a5對創(chuàng)建的F1代、回交一代、回交二代共4 321株幼苗進(jìn)行輔助選擇，篩選出抗皮爾斯病的幼苗1 683株[23]。盡管分子標(biāo)記研究在葡萄上取得了一定的進(jìn)展，但MAS在育種上的應(yīng)用仍屬于起步階段。

本研究利用葡萄無核基因SCAR標(biāo)記GSLP1-569、抗黑痘病基因RAPD標(biāo)記OPS03-1354和抗霜霉病基因RAPD標(biāo)記S416-1224，對6個(gè)雜交或自交獲得的127株胚挽救苗進(jìn)行了分子檢測，從中篩選出了無核雜種、抗黑痘病的無核雜種、抗黑痘病的有核雜種、抗霜霉病的有核雜種、抗黑痘病且抗霜霉病的有核雜種。對于篩選獲得的無核雜種單株，下一步將重點(diǎn)觀察其田間對抗黑痘病和霜霉病抗性以及結(jié)果后的無核性狀，從中選出無核葡萄新品系。而僅擁有抗病基因標(biāo)記的雜種，對其果實(shí)性狀如大粒、色澤艷麗、脆肉、可溶性固形物含量高等表現(xiàn)突出的單株可作為進(jìn)一步雜交育種的親本予以利用。

在本研究中，無核基因探針GSPL1在無核品種無核白（無核對照CK3）和火焰無核上能夠擴(kuò)增出無核基因SCAR標(biāo)記GSLP1-569，而且能夠在火焰無核自交后代中檢測出該標(biāo)記，說明無核基因探針GSLP1對與無核葡萄原始親本無核白親緣關(guān)系較近的無核品種或其雜種具有良好的檢測作用。該無核標(biāo)記未能在無核品種底來特、愛莫無核中檢測出來，從分子角度推測葡萄無核基因可能是多個(gè)，屬于數(shù)量性狀，對于以底來特、愛莫無核等無核品種作母本雜交獲得的胚挽救苗的標(biāo)記輔助選擇，還有待于進(jìn)一步研究和獲得新的無核基因標(biāo)記及其探針。同樣，抗黑痘病基因RAPD標(biāo)記OPS03-1354和抗霜霉病基因RAPD標(biāo)記S416-1224存在于中國野生葡萄中，而不存在于歐洲葡萄品種中，對歐洲葡萄無核品種×歐洲葡萄品種的雜交組合的親本及其后代不能夠進(jìn)行檢測，因此在具體的標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用中，RAPD標(biāo)記OPS03-1354和S416-1224僅適合于親本之一為中國野生葡萄的雜交后代的分子檢測。同時(shí)，將這兩個(gè)RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)換成穩(wěn)定性、專一性更好的SCAR標(biāo)記，將會進(jìn)一步提高標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性。對于不存在顯性或主效抗病基因的歐洲葡萄，研究和開發(fā)其他類型的抗病基因分子標(biāo)記將有助于對該種內(nèi)雜交后代的輔助選擇，這也將是我們今后研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。

3 結(jié)論

a.葡萄無核基因探針GSLP1對與無核葡萄原始親本無核白親緣關(guān)系較近的無核品種及其雜種具有良好的檢測無核基因和無核性狀的作用。

b.中國野生葡萄抗黑痘病基因RAPD標(biāo)記OPS03-1354和抗霜霉病基因RAPD標(biāo)記S416-1224適合于中國野生葡萄及其雜交后代的抗性檢測。

c.利用葡萄無核基因SCAR標(biāo)記GSLP1-569及中國野生葡萄抗黑痘病基因RAPD標(biāo)記OPS03-1354和抗霜霉病基因RAPD標(biāo)記S416-1224，對6個(gè)組合的127株無核葡萄胚挽救苗進(jìn)行無核、抗病的分子檢測，篩選出擁有無核基因SCAR標(biāo)記GSLP1-569的雜種有27株，其中4株同時(shí)擁有抗黑痘病基因RAPD標(biāo)記OPS03-1354。擁有抗黑痘病基因RAPD標(biāo)記OPS03-1354的雜種28株，擁有抗霜霉病基因RAPD標(biāo)記S416-1224的雜種19株，其中有10株同時(shí)擁有抗黑痘病基因和抗霜霉病基因RAPD標(biāo)記。獲得的無核、抗病葡萄雜種將為進(jìn)一步選育出新品系奠定基礎(chǔ)。

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