劉 宇

(湖南理工學院 化學化工學院, 湖南 岳陽 414006)

一組用于日本血吸蟲病診斷的多肽組合物的初步研究

劉 宇

(湖南理工學院 化學化工學院, 湖南 岳陽 414006)

為了建立一種快速簡便可用于日本血吸蟲病抗體檢測的磁珠多肽組合物-ELISA免疫診斷方法, 利用蛋白質組學和生物信息學方法篩選日本血吸蟲卵可溶性抗原和成蟲抗原肽, 制備磁珠多肽組合物結合ELISA進行血吸蟲病診斷. 實驗表明, 用磁珠多肽組合物-ELISA法診斷急性血吸蟲病26例, 慢性血吸蟲病32例, 敏感性分別為96.15%和93.75%; 檢測肝吸蟲病12例, 肺吸蟲病15例, 均為陰性. 該方法具有較高的特異性和敏感性, 是一種具有開發(fā)前景的血吸蟲診斷方法.

磁珠多肽組合物; 血吸蟲病; 免疫診斷

日本血吸蟲病是我國重點防控的寄生蟲病之一. 在血吸蟲病的防治中, 準確、及時、快速的診斷是進行有效防治的關鍵[1]. 病原學的診斷是血吸蟲病診斷的確診依據. 但病原學診斷費時費力, 在群眾中依從性差[2], 故在現實的診斷中, 一般將免疫診斷作為輔助診斷手段. 而目前免疫診斷主要采用血吸蟲蟲卵可溶性抗原作為檢測抗原[3]. 但蟲卵可溶性抗原的制備具有不均一性以及和其它寄生蟲并交叉反應等問題.本研究從血吸蟲蟲卵和成蟲可溶性抗原出發(fā), 運用生物質譜技術鑒定蟲卵可溶性抗原, 并對鑒定抗原進行生物信息學分析, 篩選日本血吸蟲特有抗原序列進行多肽合成, 運用合成多肽作為檢測抗原進行血吸蟲病診斷, 獲得高檢測敏感性, 無交叉反應的檢測方法.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清

日本血吸蟲蟲卵(由湖南省血吸蟲病防治所提供), 急性血吸蟲病血清26, 慢性血吸蟲病血清32份, 肝吸蟲病血清12份, 肺吸蟲病血清15份(由湖南省血吸蟲病防治所提供), 健康人血清60份, 感染日本血吸蟲小鼠血清50份, 正常小鼠血清50份.

1.1.2 動物

新西蘭兔, 小鼠由中南大學實驗動物中心提供.

1.1.3 日本血吸蟲感染陽性釘螺

由湖南省血吸蟲病防治研究所提供.

1.1.4 主要試劑

HRP-Protein A進口分裝, TMB由上海華美生物工程公司提供, 磁珠和磁力架由長春博得生物工程有限公司提供, 丙烯酰胺, 雙丙烯酰胺, 過硫酸銨為進口分裝, TEMED由上海華美生物工程公司提供.

1.2 方法

1.2.1 日本血吸蟲蟲卵和成蟲可溶性抗原收集

成年新西蘭兔10只, 用常規(guī)方法感染, 每只感染1000條日本血吸蟲尾蚴, 于35天后處死白兔, 收集血清, 用Protein A agarose純化抗體; 解剖取肝臟, 低速勻漿, 260目過濾, 收集蟲卵; 取純化蟲卵0.2克,研磨, 生理鹽水提取可溶性抗原, 沖洗門靜脈, 收集成蟲, 液氮研磨, 提取可溶性抗原, 將蟲卵可溶性抗原和成蟲可溶性抗原混合.

1.2.2 可溶性抗原免疫親和純化

純化的抗體用PBS透析, 將純化抗體固定到磁珠制備成免疫磁珠, 將免疫磁珠和可溶性抗原雜交, 收集沉淀, 洗脫, 收集抗原, 加上樣緩沖液變性, SDS-PAGE分離.

1.2.3 可溶性抗原鑒定

SDS-PAGE分離可溶性抗原蛋白條帶切取, 洗滌脫色, Trypsin膠內酶解37℃酶解過夜, 回收酶解產物, ESI-MS/MS鑒定酶解產物, 數據庫掃描, 確定抗原信息.

1.2.4 抗原生物信息學分析

選取堅定的抗原在生物信息學軟件DNAstar上進行抗原分析, 選取高免疫原性抗原片段進行blastp分析, 選取高特異性抗原片段.

1.2.5 抗原片段合成

生物信息學分析獲得的高免疫原性、高特異性抗原片段采用Fmoc法進行多肽固相合成, 合成的多肽片段用RP-HPLC純化, MALDI-TOF鑒定, 確定合成多肽正確.

1.2.6 單個多肽片段ELISA分析

氨基磁珠500μL, 磁力作用下去上清, 加入5%的戊二醛溶液醛化1h,磁力作用下去上清, 洗滌磁珠; 取50mg合成多肽溶解在1000μL 0.01mol/L的PBS溶液中, pH7.4, 偶聯1 h, 磁力作用下去上清, 洗滌3次;相同作用條件下取1%的BSA封閉1 h, 磁力作用下去上清, 洗滌3次, 即為磁珠多肽. 取血吸蟲陽性兔血清標本20份, 陰性兔血清標本20份進行磁珠多肽評價, 取磁珠多肽10 μL, 磁力作用5min下去上清, 加50μL血清樣品, 37℃溫育30min, 磁力作用5min下去上清, 洗滌3次, 加入HRP-Protein A工作液50μL, 輕輕混勻, 37℃溫育30min, 磁力作用下去上清, 加入50μL底物顯色液, 37℃溫育15 min, 加入150μL反應終止液, 磁力作用下10 min取上清, 酶標儀上測定OD值.

日本血吸蟲蟲卵和成蟲可溶性抗原親和純化SDS-PAGE圖

1.2.7 磁珠多肽組合物-ELISA分析

氨基磁珠5000μL, 磁力作用下去上清, 加入5%的戊二醛溶液醛化1h, 磁力作用下去上清, 洗滌磁珠; 取500mg按等質量比混合的合成多肽混合物溶解在1000μL0.01mol/L的PBS溶液中, pH7.4, 偶聯1h, 磁力作用下去上清, 洗滌3次; 相同作用條件下取1%的BSA封閉1h, 磁力作用下去上清, 洗滌3次, 即為磁珠多肽組合物. 取血吸蟲病急性患者血清26份, 慢性患者血清32份, 肝吸蟲病患者血清12份, 肺吸蟲病患者血清15份, 健康人血清60份, 進行ELISA分析, 分析方法同上.

2 結果

2.1 日本血吸蟲可溶性抗原免疫純化結果

純化的感染日本血吸蟲陽性血清偶聯至磁珠后與日本血吸蟲蟲卵和成蟲可溶性抗原免疫親和純化, SDS-PAGE分離, 結果如圖所示. 可溶性抗原免疫親和純化, SDS-PAGE分離, 酶解后進行數據庫掃描, 獲得結果見表1.

表1 Mascot數據庫掃描獲得的部分蛋白信息

2.2 磁珠多肽組合物-ELISA分析

蟲卵可溶性蛋白經生物信息學分析獲得抗原肽經固相多肽合成, RP-HPLC純化, MALDI-TOF分析, 證實合成正確, 偶聯至磁珠進行單個多肽磁珠-ELISA分析, 確定4個肽可用于進行ELISA分析, 20份陽性兔血清全部為陽性, 20份兔陰性血清全部為陰性, 說明4個多肽可用于進行血吸蟲病檢測, 將多肽組合物制備成磁珠多肽組合物進行ELISA檢測, 檢測結果見表2.

表2 磁珠多肽組合物-ELISA法檢測結果

3 討論

檢測血吸蟲病病人血清中特異性抗體的方法是血吸蟲病檢測開展最早、使用最廣泛的檢測方法, 也是目前實驗室研究最多的方法. 開展血吸蟲病特異性抗體的檢測, 主要是特異性抗原的制備. 目前市場上使用最多的是血吸蟲蟲卵可溶性抗原,用蟲卵抗原作為俘獲抗原, 敏感性高, 但特異性不強. 現在各實驗室主要尋找特異性抗原并進行分子生物學表達來獲得俘獲抗原, 然而重組抗原難于獲得高純度抗原, 從而導致重組抗原在免疫分析時特異性較差[4]. 至今尚未找到一種既有高特異性和敏感性, 又容易表達獲得的分子. 本實驗運用蛋白質組學方法分析血吸蟲蟲卵和成蟲抗原, 并對獲得的抗原進行生物信息學分析, 獲得多條具有高特異性和高免疫原性多肽片段, 并通過實驗篩選獲得可以作為俘獲抗原的多肽組合物, 結合免疫磁珠技術, 獲得的磁珠多肽組合物-ELISA方法完全可以進行血吸蟲病檢測.

[1] 曾小軍, 陳紅根, 袁建華, 等. 快速膠體金免疫層析法的建立及其對血吸蟲病的診斷效果[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2005, 17(1): 24～27

[2] 沈 健. 蟲卵組分抗原ELISA診斷血吸蟲病的臨床價值[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 2000, 12(6):371～373

[3] 朱明東, 洪玲娣, 卓敏敏, 等. 日本血吸蟲蟲卵分離方法的改進[J]. 中國血吸蟲病防治雜志, 1998,10(3):170～171

[4] Ham ilton JV, KlinertM , DoenhoffMJ.Diagnosis of schistosomiasis: antibody detection, with notes on parasitological and antigen detection methods[J]. Parasito logy, 1998, 117( supp l) : 41257

A Preliminary Study of Peptide Composition for the Diagnosis of Schistosomiasis

LIU Yu
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hunan College of Science and Technology, Yueyang 414006, China)

Magnetic peptides ELISA for diagnosis of schitosomiasis is established by using the SEA and AWA peptides as the target antigens from proteomics and bilinformatics. It is shown that the sensitivity of magnetic peptides ELISA is 96.15% in the acute cause of Schitosomiasis and 93.75% in the chronic cause of Schitosomiasis. The cross-reaction rates are not exist in the clonorchiasis cases and paragonimiasis cases. This method is a simple assay with higher sensitivity and specificity method and for application Schitosomiasis diagnosis.

Magnetic peptides; Schitosomiasis; ELISA

R383. 2+4

A

1672-5298(2010)03-0060-03

2010-05-04

湖南省教育廳青年基金項目(07Y029)

劉 宇(1972- ), 男, 湖南益陽人, 湖南理工學院化學化工學院副教授. 主要研究方向: 蛋白質結構與功能研究