孫妍,張國財(cái),劉瑞鵬,趙楊,張欣倩,孫實(shí),馬力

(1.東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱 150040;2.黑龍江省平山林業(yè)制藥廠)

走馬芹[1](Angelica dahurica):傘形科,當(dāng)歸屬。多年生大型草本植物,株高100cm左右。根灰褐色,具辛辣香氣,辣氣較香氣重。主要生長在山地河谷、草甸,山坡林緣、林間草地。中國主要分布在東北和華北地區(qū)。主要化學(xué)成分:含佛手柑內(nèi)酯(bergapten)、二氫山芹當(dāng)歸油酯(columbianadin)、二氫山芹醇(columbianetin)、二氫山芹醇乙酸酯、傘花內(nèi)酯(umbelliferone)、當(dāng)歸醇A-H(angelol A-H)及東茛菪內(nèi)酯等多種香豆精類化合物。

楊樹爛皮病[2]〔Cytospora chrysosperma(Pers.)Fr.〕:我國楊樹栽培區(qū)都有發(fā)生,但主要分布在東北、西北、華北等地。危害各種楊樹(Populus spp.),以及旱柳(Salix matsudana)、榆(Ulmus pumila)、板栗(Castanes millissima)、槭(Acer spp.)、桑(Morus alba)、接骨木(Sambucus spp.)、木槿(Hibiscus syriacus)、花楸(Catalpa ovata)等。是公園、綠地、行道樹和苗圃楊樹的常見病和多發(fā)病,常引起行道樹大量枯死,新移栽的楊樹發(fā)病尤重。近幾年,楊樹爛皮病的發(fā)生量及發(fā)生程度呈上升的趨勢[3]。

本研究從生物活性的角度對走馬芹的抑菌性進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)其具有較強(qiáng)的抑菌作用。

1 材料和方法

1.1 供試植物和菌種

供試走馬芹采自黑龍江省伊春市涼水國家級自然保護(hù)區(qū)。

供試楊樹爛皮病菌種由發(fā)病楊樹上分離鑒定得到。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器。DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、FDV高速風(fēng)選式超細(xì)粉碎機(jī)、DK-S26型電熱恒溫水浴鍋、AS20500A型超聲波清洗器、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHB-IIIA循環(huán)水式多用真空泵、HPG-400光照培養(yǎng)箱。

1.2.2 試劑。分析乙醇、聚山梨酯-80、瓊脂、葡萄糖、馬鈴薯、

1.3 植物提取物母液的制備[4-5]

將走馬芹放入干燥箱中干燥、粉碎。取 10g裝入300mL三角瓶中,加入80%乙醇250 mL,置于50℃恒溫水浴鍋內(nèi)溫浸3h,然后放到超聲波提取器中振蕩40min,取出再置于50℃恒溫水浴鍋內(nèi)溫浸3h,然后將浸好的藥液用真空泵減壓抽濾,得到澄清的乙醇粗提液。將乙醇粗提液在40℃下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮,減壓濃縮至原液呈現(xiàn)出濃油狀為止,用10%的聚山梨酯-80作為溶媒進(jìn)行溶解定容至50mL(即質(zhì)量濃度為200mg/mL),物理滅菌后備用。

1.4 抑菌活性測定方法

1.4.1 PDA培養(yǎng)基的制備。將洗凈去皮的馬鈴薯200g切碎,加水1000mL煮沸30 min,用紗布濾去馬鈴薯,加水補(bǔ)足1000mL,然后加18g瓊脂和20g蔗糖,加熱使瓊脂完全溶化,趁熱用紗布過濾,而后分裝三角瓶中,加棉花塞后在121℃下加壓蒸汽滅菌20min后備用。

1.4.2 帶毒平板培養(yǎng)基的制備。精確取不同量的母液分別與熱的PDA培養(yǎng)基均勻混合于培養(yǎng)皿內(nèi),使其體積達(dá)到10mL,冷凝后即成為不同濃度的帶毒培養(yǎng)基。

1.4.3 生長速率法測定抑菌率[6]。在超凈工作臺內(nèi),用直徑為5mm的打孔器在培養(yǎng)好的菌落外緣切下帶菌培養(yǎng)基菌餅。用滅過菌的接種針小心將菌餅放置在帶毒培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基上,菌絲面向下,每皿接一塊,置于26℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每隔24h觀察1次,用十字交叉法測量菌落直徑兩次,取平均值。根據(jù)公式(1)和(2)計(jì)算菌絲生長抑制率:

2 結(jié)果與分析

以觀察時(shí)間為橫坐標(biāo),對楊樹爛皮病菌的抑制率為縱坐標(biāo)作圖(見圖1)。由圖1可知,不同濃度的走馬芹提取物均在48h后對楊樹爛皮病原菌產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用,并持緩慢增長趨勢。

以濃度為橫坐標(biāo),對楊樹爛皮病菌的抑制率為縱坐標(biāo)作圖(見圖2)。由圖2可知,不同濃度的走馬芹提取物對楊樹爛皮病菌的抑制作用呈對數(shù)增長趨勢。曲線方程為:

Y=2.8625Ln(X)+76.055復(fù)合系數(shù) R2為 99.27%,由此可計(jì)算出 EC50為 0.11μ g/mL。

圖1 不同濃度提取物

圖2 走馬芹提取物對楊樹爛皮病菌抑制曲線圖

3 結(jié)論

將超聲技術(shù)應(yīng)用于走馬芹活性物質(zhì)的提取,不僅保持有效成分的活性,同時(shí)節(jié)省時(shí)間,簡化提取純化流程,提高提取效率。本文探討了走馬芹的80%乙醇超聲波提取物對楊樹爛皮病原菌的抑制作用,結(jié)果表明,走馬芹的提取物對楊樹爛皮病原菌有較強(qiáng)的抑制作用,提取物的濃度與抑制作用呈正相關(guān)關(guān)系,其抑制率呈對數(shù)增長趨勢。

[1] 聶紹荃,袁曉穎.黑龍江省植物資源志[M].東北林業(yè)大學(xué)出版社,2003.

[2] 周仲銘.林木病理學(xué)[M].中國林業(yè)出版社,2005:164-167.

[3] 信桂芳,王惠玲.楊樹腐爛病發(fā)生現(xiàn)狀調(diào)查分析及應(yīng)對措施[J].河北林業(yè)科技,2007(2):24.

[4] 張全軍,王澤南.超聲波波提取荸薺皮抑菌物質(zhì)的工藝研究[J].食品與機(jī)械,2007,23(6):59-61.

[5] 紀(jì)淑娟.丁香抑菌成分超聲波提取工藝研究[J].食品科學(xué),2008,29(05):201-204.

[6] 方中達(dá).植病研究方法[M].3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1998:151-154