許秋巖，趙詠梅，趙志煒，姬志娟，閆 穎

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053;2.中央民族大學(xué)醫(yī)院眼科，北京 100081)

花生油對2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)生長因子及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響

許秋巖1，2，趙詠梅1，趙志煒1，姬志娟1，閆 穎1

(1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053;2.中央民族大學(xué)醫(yī)院眼科，北京 100081)

目的 通過觀察2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)生長因子(NGF)和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)表達(dá)的改變，研究花生油對2型糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元NGF及ChAT表達(dá)的影響，探討花生油在防治糖尿病腦病中的作用。方法 60只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組:正常對照組(C組)、2型糖尿病組(T2DM組)、2型糖尿病給予2mL花生油組(T2DM+2mL組)及2型糖尿病給予5mL花生油組(T2DM+5mL組)。其中C組給予正常飲食，糖尿病組大鼠給予高脂飲食喂養(yǎng)，2個月后，按25 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)制成2型糖尿病模型，T2DM組、T2DM+2mL組及T2DM+5mL組大鼠繼續(xù)給予高脂飲食。糖尿病造模1個月后處死全部大鼠，行腦冰凍切片，用免疫組織化學(xué)方法檢測各組大鼠海馬CA1區(qū)NGF和ChAT的表達(dá)。結(jié)果(1)T2DM組大鼠海馬CA1區(qū)NGF表達(dá)比C組明顯降低(P＜0.05)，T2DM+2mL組及T2DM+5mL組大鼠海馬CA1區(qū)NGF表達(dá)均明顯高于未給予花生油的T2DM組(P＜0.05)。(2)T2DM組大鼠海馬CA1區(qū)ChAT表達(dá)顯著低于C組(P＜0.05)，T2DM+2mL組和T2DM+5mL組大鼠海馬CA1區(qū)ChAT表達(dá)均明顯高于未給予花生油的T2DM組(P＜0.05)。結(jié)論 2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)生長因子表達(dá)降低，膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少，這可能是2型糖尿病腦病發(fā)生的原因之一?；ㄉ湍茉黾?型糖尿病大鼠海馬區(qū)內(nèi)神經(jīng)生長因子表達(dá)，促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元存活，表明花生油具有一定的保護(hù)大鼠糖尿病腦病的作用。

2型糖尿病;神經(jīng)生長因子;膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶;花生油;大鼠

隨著生活水平的提高，2型糖尿病(type 2 diabetic mellitus，T2DM)的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)逐年增加。目前已有大量研究表明糖尿病可造成認(rèn)知功能障礙，以獲得性認(rèn)知和行為缺陷為特征，稱為糖尿病腦病(diabetic encephalopathy)［1］。糖尿病腦病的神經(jīng)生理學(xué)和影像學(xué)特點與老年性癡呆(Alzheimer’s disease，AD)十分相似，因此，糖尿病是 AD 的危險因素［2，3］。

花生、花生油的營養(yǎng)很豐富，富含油酸、亞油酸等成份，其中油酸為單不飽和脂肪酸，具有降低高血脂癥患者血脂水平以及預(yù)防心血管疾病的作用，每日進(jìn)食少量花生能降低患2型糖尿病的危險性［4，5］。本課題組以往的研究表明花生油具有降低2型糖尿病大鼠血脂、血糖及調(diào)節(jié)其胰島素分泌的作用［6］。本研究用花生油喂食2型糖尿病大鼠1個月，觀察花生油對2型糖尿病大鼠海馬區(qū)神經(jīng)生長因子(NGF)及膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)表達(dá)的影響，探討花生油在防治糖尿病腦病中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

8周齡健康雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠60只，體質(zhì)量250～300 g，SPF級，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所。

1.2 主要試劑與儀器

鏈尿佐菌素(STZ，美國Sigma公司)，兔來源的NGF、ChAT多克隆抗體(本研究室自行制備)，Sp免疫組化試劑盒(Zymed Laboratories公司)，花生油為購買于超市的普通食用花生油，血糖儀及血糖試紙購買于羅氏公司。

1.3 動物模型的制備及取材

60只SD大鼠隨機(jī)分成4組:正常對照組(C組)、2型糖尿病組(T2DM組)、2型糖尿病給予2mL花生油組(T2DM+2mL組)及2型糖尿病給予5mL花生油組(T2DM+5mL組)。其中C組給予正常飲食，其余三組給予高脂飲食。2個月后，給予高脂飲食的三組大鼠腹腔注射少量STZ(按25 mg/kg體質(zhì)量給藥)，3 d后檢測大鼠尾部非禁食血糖，大于15mmol/L認(rèn)為2型糖尿病模型制作成功。T2DM組、T2DM+2mL組及 T2DM+5mL組大鼠繼續(xù)給予高脂飲食，T2DM+2mL組大鼠在2型糖尿病造模同時每日給予2mL花生油灌胃，T2DM+5mL組大鼠每日給予5mL花生油灌胃。1個月后，大鼠按360 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射10%水合氯醛，麻醉成功后開胸暴露心臟，于大鼠左心室快速插管灌注生理鹽水，同時剪開右心耳，用4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定液(pH 7.4)快速灌流100mL后，再緩慢灌流30 min，至大鼠僵硬，肝臟變白，取腦組織浸于含30%蔗糖的4%多聚甲醛溶液，至腦下沉，用于免疫組織化學(xué)染色。

1.4 免疫組織化學(xué)染色及半定量分析

行大鼠海馬部位冰凍切片，厚度為60 μm，分別進(jìn)行NGF及ChAT抗體免疫組織化學(xué)染色。按說明書方法進(jìn)行實驗，具體步驟如下:3%過氧化氫室溫20 min;PBS緩沖液洗3次，每次5 min;滴加5%的正常羊血清室溫20 min;滴加Ⅰ抗(NGF抗體做1∶1 000稀釋，ChAT抗體做 1∶500稀釋)，4℃過夜，陰性對照不加一抗;次日，PBS緩沖液洗3次，每次5 min;滴加 II抗，山羊抗兔 IgG(1∶100)，室溫孵育30 min;PBS緩沖液洗3次，每次5 min;用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。光學(xué)顯微鏡觀察。

免疫組化定量分析:每組大鼠各5只，每只大鼠于海馬部位連續(xù)切片，每隔4張取1張，共取15張切片，在20倍物鏡下分別記錄4組大鼠海馬 CA1區(qū)NGF及ChAT陽性染色細(xì)胞數(shù)目。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬 CA1區(qū)NGF免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

C組大鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)有大量深染的NGF陽性染色神經(jīng)元，高倍鏡下其胞核淡染，胞質(zhì)和突起深染，突起分枝多，可見3～4級樹突分支(圖1A)。T2DM組大鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)NGF陽性染色神經(jīng)元數(shù)目比C組大鼠明顯減少，染色淺(圖1B)。T2DM+2mL組大鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)NGF陽性染色神經(jīng)元數(shù)目比未給予花生油的T2DM組大鼠增加(圖1C)，T2DM+5mL組大鼠海馬 CA1區(qū)內(nèi) NGF陽性染色神經(jīng)元數(shù)目及染色程度比未給予花生油的T2DM組大鼠明顯增加(圖1D)。

2.2 大鼠海馬CA1區(qū)ChAT免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

C組大鼠海馬CA1區(qū)表達(dá)ChAT的陽性神經(jīng)元數(shù)目多，染色深 (圖2A)，陽性細(xì)胞胞核基本不著色，胞漿和突起深染，突起多為樹突，可見分支。T2DM組大鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)ChAT陽性染色神經(jīng)元數(shù)目及染色程度均比C組大鼠明顯減少(圖2B)。T2DM+2mL組大鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)ChAT陽性染色神經(jīng)元數(shù)目比未給予花生油的T2DM組大鼠明顯增加，染色程度加深(圖2C)，T2DM+5mL組大鼠海馬CA1區(qū)內(nèi)ChAT陽性染色神經(jīng)元數(shù)目及染色程度比未給予花生油的T2DM組大鼠明顯增加(圖2D，圖1，2見彩插1)。

2.3 免疫組織化學(xué)半定量分析結(jié)果

4組大鼠海馬CA1區(qū) NGF及 ChAT免疫組化陽性染色細(xì)胞數(shù)目比較見表1。

表1 4組大鼠海馬CA1區(qū)NGF及ChAT陽性染色細(xì)胞數(shù)目比較(±s)Tab.1 Numerical comparison of cells stained positively with NGF and ChAT antibodies in the hippocampal CA1 area of the four groups of rats(±s)

表1 4組大鼠海馬CA1區(qū)NGF及ChAT陽性染色細(xì)胞數(shù)目比較(±s)Tab.1 Numerical comparison of cells stained positively with NGF and ChAT antibodies in the hippocampal CA1 area of the four groups of rats(±s)

與C組相比，*P＜0.05;與T2DM組相比，#P＜0.05

n NGF ChAT C組分組Group 例數(shù)5 30.87±2.06 39.20±2.58 T2DM組 5 12.33±1.08* 8.73±1.16*T2DM+2mL組 5 17.53±2.25*# 20.40±1.22*#T2DM+5mL組 5 19.13±1.15*# 23.53±1.65*#

3 討論

目前，越來越多的研究證實，糖尿病可造成以獲得性認(rèn)知和行為缺陷為特征的認(rèn)知功能障礙，稱為糖尿病腦病［1］。1型糖尿病人認(rèn)知功能損害主要在聯(lián)想記憶和學(xué)習(xí)技能注意力方面;2型糖尿病人認(rèn)知功能損害主要在學(xué)習(xí)和記憶方面，可能存在記憶提取過程的缺陷。糖尿病腦病本身并無特征性的神經(jīng)病理改變，尸檢顯示病理變化以AD的改變?yōu)橹?，血管性癡呆的改變?yōu)檩o［2，3］。糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其確切機(jī)制目前尚不完全清楚，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)糖尿病腦病和老化的發(fā)病機(jī)制有著高度的相似性。

2型糖尿病在臨床上以血糖增高為主要表現(xiàn)，以高胰島素血癥和胰島素抵抗為病理基礎(chǔ)。本課題組以往的研究表明，給大鼠高脂飲食2個月，可使大鼠產(chǎn)生高脂血癥(高三酰甘油血癥)、高胰島素血癥及輕度的血糖升高。之后再給大鼠腹腔注射亞致病劑量的STZ破壞部分胰島β細(xì)胞功能，可導(dǎo)致大鼠血胰島素和血糖水平明顯高于對照組［6］。因此，本研究采用的動物模型較好地模擬了2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展過程。

NGF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，能支持成熟神經(jīng)元的存活。文獻(xiàn)報道，NGF能夠促進(jìn)成年大鼠海馬區(qū)谷氨酸及多巴胺的釋放，從而激活神經(jīng)存活信息轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起相關(guān)基因組有序的轉(zhuǎn)錄［7］。增加海馬區(qū)NGF水平能夠減少老化鼠的腦神經(jīng)元凋亡，從而降低腦組織老化和神經(jīng)元損害的風(fēng)險［8］。本研究結(jié)果顯示，2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)NGF表達(dá)比正常對照大鼠明顯減少，說明2型糖尿病大鼠海馬神經(jīng)元處于低營養(yǎng)或營養(yǎng)缺乏狀態(tài)，神經(jīng)存活信息轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑處于低激活狀態(tài)，因此，2型糖尿病大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元受損的危險性增加。ChAT是催化乙酰膽堿(Ach)合成的酶，也是膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志物。很多研究表明，膽堿能系統(tǒng)功能缺陷與AD密切相關(guān)，Ach活性不足是AD的早期異常表現(xiàn)，Ach減少的程度與癡呆的嚴(yán)重性呈正相關(guān)［9］。動物實驗提示腦內(nèi) Ach不足與學(xué)習(xí)記憶能力缺陷有關(guān)［10］。本研究結(jié)果顯示，2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)ChAT表達(dá)比正常對照大鼠明顯減少，說明2型糖尿病大鼠膽堿能神經(jīng)元變性丟失。NGF表達(dá)減少可能是導(dǎo)致2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)膽堿能神經(jīng)元變性丟失的原因之一。NGF及膽堿能神經(jīng)元數(shù)量減少可能與2型糖尿病引起的學(xué)習(xí)記憶損傷密切相關(guān)。本課題組已往的研究表明［11－13］，用STZ造模的1型糖尿病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降、海馬超微結(jié)構(gòu)受損、神經(jīng)營養(yǎng)因子和 NGF表達(dá)減少、ChAT表達(dá)減少，表明1型糖尿病小鼠存在糖尿病腦病。本研究結(jié)果顯示，2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)NGF表達(dá)減少、ChAT表達(dá)減少，說明2型糖尿病大鼠亦存在糖尿病腦病。

花生、花生油的營養(yǎng)豐富，富含油酸、亞油酸等成份，其中油酸為單不飽和脂肪酸，攝入單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸能增強(qiáng)機(jī)體應(yīng)用胰島素的能力，因此，每日進(jìn)食少量花生能降低患2型糖尿病的危險性［4，5］。油酸可使大鼠胰腺 β 細(xì)胞分泌胰島素增加，給2型糖尿病KKAy小鼠喂食富含花生油中油酸成分的飲食可使其血糖水平比喂食不含油酸成分高脂飲食的2型糖尿病KKAy小鼠明顯降低［14］。本課題組以往的研究表明，花生油可降低2型糖尿病大鼠血脂水平，并有可能通過調(diào)節(jié)胰島素水平降低糖尿病大鼠的血糖［6］，說明花生油有防治2型糖尿病的作用。本研究結(jié)果顯示，每日給予2mL或5mL的花生油可增加2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)NGF和 ChAT的表達(dá)，NGF及ChAT陽性染色細(xì)胞數(shù)目比未給予花生油的2型糖尿病大鼠明顯增加，表明花生油有促進(jìn)2型糖尿病大鼠腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌、促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元存活的作用。因此，花生油具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，能在一定程度上防治糖尿病腦病，其作用機(jī)理可能與花生油中的某些成分能調(diào)節(jié)糖尿病大鼠的血脂、血糖水平、調(diào)控胰島素的分泌和作用有關(guān)，也可能與花生油中的油酸成分具有神經(jīng)營養(yǎng)作用有關(guān)［15］，其具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

由于花生油是人們?nèi)粘Ｉ钪械某Ｓ檬称?，沒有任何毒副作用?；ㄉ椭袉尾伙柡椭舅岷枯^高，平均45%左右，僅次于橄欖油，明顯高于大豆油和菜籽油，且花生油價格比橄欖油優(yōu)惠很多［16］，因此，花生油是2型糖尿病病人理想的食用油。2型糖尿病病人在控制總攝入熱量的前提下，食用一定量的花生油可有助于預(yù)防糖尿病腦病的發(fā)生。

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Effect of Peanut Oil on Expression of NGF and ChAT in Hippocampal CA1 Area of Type 2 Diabetic Rats

XU Qiu－yan1，2，ZHAO Yong－mei1，ZHAO Zhi－wei1，JI Zhi－juan1，YAN Ying1
(1.Key Laboratory of Neurodegenerative Diseases，Ministry of Education，Xuan Wu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China;2.Department of Ophthalmology，Hospital of Minzu University of China，Beijing 100081，China)

Objective To study the expression of nerve growth factor(NGF)and cholineacetyltransferase(ChAT)in hippocampal CA1 area of type 2 diabetes rats and to investigate whether peanut oil has protective effect on diabetes encephalopathy.Methods Sixty healthy male SD rats were assigned randomly into 4 groups:normal control group(group C);type 2 diabetes mellitus group(group T2DM);type 2 diabetes mellitus treated with 2mL peanut oil group(T2DM+2mL group)and type 2 diabetes mellitus treated with 5mL peanut oil group(T2DM+5mL group).After two months of high－fat food feeding，type 2 diabetes mellitus was induced by intraperitoneal injection of streptozotocin(STZ)in a low dose(25 mg/kg body weight).All the rats were killed at one month after the diabetes mellitus induction.The expression of NGF and ChAT in hippocampal CA1 area of rats was detected by immunohistochemical staining.Results(1)The expression of NGF in hippocampal CA1 area of T2DM group decreased significantly compared with that of control group(P＜0.05).The expression of NGF in hippocampal CA1 area of T2DM+2mL group and T2DM+5mL group increased significantly compared with that of T2DM group(P＜0.05).(2)The expression of ChAT in hippocampal CA1 area of T2DM group decreased significantly compared with that of control group(P＜0.05).The expression of ChAT in hippocampal CA1 area of T2DM+2mL group and T2DM+5mL group increased significantly compared with that of T2DM group(P＜0.05).Conclusion The expression of NGF and the number of cholinergic neurons decrease in the hippocampal CA1 area of type 2 diabetes rats.This might be one of the reasons that causes diabetes encephalopathy.Peanut oil improves the expression of NGF in hippocampal CA1 area and promotes the survival of cholinergic neurons in type 2 diabetes rats，suggesting that peanut oil has a protective effect on diabetic encephalopathy.

Type 2 diabetes mellitus;Nerve growth factor;Cholineacetyltransferase;peanut oil;Rat

R581.7

A

1671－7856(2010)08－0018－04

2010－04－08

教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金資助項目;北京市留學(xué)人員科技活動擇優(yōu)資助項目。

許秋巖(1973－)，女，副主任醫(yī)師，E－mail:qiuyanxu@163.com。

趙詠梅(1968－)，女，博士，副研究員，電話:010－83198854，電子信箱:yongmeizhao@hotmail.com。