鐘水清，樓克忻

(浙江省松陽(yáng)縣人民醫(yī)院感染科，浙江 麗水 323400)

目前研究認(rèn)為，病毒和機(jī)體免疫狀態(tài)是乙型肝炎病毒(HBV)感染人體后病情發(fā)展方向的決定因素，而Th應(yīng)答類型與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)[1]。正常情況下Th1/Th2處于動(dòng)態(tài)平衡中，Th1/Th2的不平衡激活可造成疾病的不同病理狀態(tài)，Th1/Th2比例是否失衡是制約機(jī)體能否有效清除病毒和病毒感染細(xì)胞的主要因素之一[2]，而干擾素-γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)是維持Th1/Th2細(xì)胞比例的關(guān)鍵分子。拉米夫定是一種能強(qiáng)烈抑制HBV復(fù)制的雙脫氧核苷類藥物，是目前廣泛應(yīng)用的抗HBV藥物，Th1/Th2的平衡失調(diào)可能是拉米夫定長(zhǎng)期應(yīng)用易發(fā)生變異、停藥后易發(fā)生反跳的原因[3]。本研究觀察了拉米夫定對(duì)慢性乙型肝炎患者外周血Th1/Th2細(xì)胞因子、HBV-DNA含量及肝纖維化指標(biāo)的影響，以探討其治療慢性乙型肝炎的療效及作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2008年1月至2009年6月在我院感染科門診或住院治療的輕中度慢性乙型肝炎患者50例作為治療組，其中男34例，女16例;年齡20～59歲，平均(35.7±9.2)歲;診斷參照2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)制訂的病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，治療前HBV-DNA均陽(yáng)性，排除其他類型肝炎病毒重疊感染。以正常健康體檢者30例作為對(duì)照組，其中男20例，女10例;年齡18～60歲，平均(34.8±9.7)歲。兩組患者的性別、年齡比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 治療方法

治療組患者給予拉米夫定片(葛蘭素制藥有限公司)100 mg，每日1次，療程為6個(gè)月。

1.3 觀察指標(biāo)

分別在治療前和治療6個(gè)月后檢測(cè)治療組患者外周血Th1和Th2細(xì)胞因子、HBV-DNA及肝纖維化指標(biāo)的變化，而對(duì)照組只測(cè)定1次。抽取靜脈血4 mL，置乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，常規(guī)分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，以磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，10%FCS-1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞濃度為2×106/mL，接種入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 mL，做3個(gè)復(fù)孔，用植物血凝素(PHA)誘導(dǎo)其增殖，終質(zhì)量濃度為200 μg/mL，置37℃及5%CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，收集上清液，置-80℃?zhèn)錂z。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)上清液中IL-4和IFN-γ含量，試劑盒購(gòu)于深圳晶美生物工程有限公司。采用熒光探針聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測(cè)HBV-DNA，試劑盒購(gòu)自上海復(fù)星生物技術(shù)有限公司。采用放免分析法檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)如透明質(zhì)酸(HA)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)、層黏蛋白(LN)，試劑由上海海軍醫(yī)學(xué)研究所提供。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

兩組觀察指標(biāo)比較見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，與對(duì)照組比較，治療組患者外周血培養(yǎng)上清液PBMC中IFN-γ水平明顯下降(P＜0.01)，而IL-4水平明顯上升(P＜0.01);經(jīng)拉米夫定治療6個(gè)月后，IFN-γ水平明顯上升(P＜0.05)，而IL-4水平(P＜0.05)和HBV-DNA含量明顯下降(P＜0.01)。經(jīng)拉米夫定治療6個(gè)月后，治療組患者肝纖維化指標(biāo)均較治療前明顯下降(P＜0.05)。

表1 兩組觀察指標(biāo)比較(±s)

表1 兩組觀察指標(biāo)比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，＊P ＜0.01;與治療前比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組別 外周血培養(yǎng)上清液PBMC中細(xì)胞因子水平和HBV-DNA含量(ng/L) 肝纖維化指標(biāo)(μg/L)HA IL-4 45.15±13.89 85.24±26.69＊54.56±18.62△IFN-γ 272.45±69.86 157.94±41.75＊237.45±50.62△HBV-DNA PCⅢ Ⅳ-C LN對(duì)照組治療組 治療前治療后2.15×108±4.19×107 5.34×105±6.52×104▲215.13±52.46 142.37±38.56△180.91±59.26 126.72±40.24△102.38±36.29 72.12±27.46△157.68±42.42 112.4±39.35△

3 討論

拉米夫定是第1個(gè)在我國(guó)和全球被批準(zhǔn)用于治療慢性乙型肝炎的口服藥。其作用機(jī)制通過(guò)抑制HBV-DNA多聚酶的活性而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，可迅速抑制HBV-DNA復(fù)制，降低HBV-DNA水平，而且能重建HBV特異性細(xì)胞免疫[5]。徐立新等[6]研究發(fā)現(xiàn)，拉米夫定治療乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)陽(yáng)性輕度慢性乙型肝炎，抑制了HBV的復(fù)制，調(diào)節(jié)了患者的細(xì)胞免疫功能，減輕了肝臟的炎癥反應(yīng)及纖維化，有利于病毒的清除。何登明等[3]研究發(fā)現(xiàn)，拉米夫定治療慢性乙型肝炎，可以促進(jìn)機(jī)體生成更多的IFN-γ，以促進(jìn)抗HBV免疫恢復(fù)，Th1/Th2平衡在拉米夫定療程中的變化可以作為療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。

特定免疫應(yīng)答及其效應(yīng)機(jī)制主要由分泌不同細(xì)胞因子的Th亞群細(xì)胞調(diào)節(jié)，Th1細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素 -12(IL-12)、IFN-γ和腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，在抵御胞內(nèi)病原微生物方面起著重要作用;Th2主要分泌IL-4、白細(xì)胞介素-5(IL-5)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)，調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)，在抵御胞外病原微生物感染方面發(fā)揮作用?？共《臼锹訦BV感染治療的一個(gè)重要手段，機(jī)體清除HBV的關(guān)鍵是健全的特異性免疫功能，抗病毒治療則可強(qiáng)化機(jī)體的清除病毒能力，最終清除病毒還需機(jī)體的特異性免疫功能，因此細(xì)胞免疫在抗HBV感染中起著核心作用。Th1/Th2細(xì)胞的平衡被打破在慢性HBV感染中的作用，日益受到人們關(guān)注。Th2細(xì)胞因子與HBV感染的慢性化有關(guān)，Th1型細(xì)胞因子與肝組織的炎癥活動(dòng)相關(guān)，并有利于病毒的清除[7]。如果Th1細(xì)胞亞群占優(yōu)勢(shì)，將促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的活性，從而清除細(xì)胞內(nèi)病毒，同時(shí)加重肝細(xì)胞的損傷;如果Th2細(xì)胞亞群占優(yōu)勢(shì)，將促進(jìn)體液免疫反應(yīng)，并抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)，使細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)細(xì)胞活性減弱，肝細(xì)胞損傷減輕。在慢性乙型肝炎中，以Th2應(yīng)答為主，但隨著炎癥活動(dòng)的加劇，Th1型細(xì)胞因子比例增加。Th1/Th2類細(xì)胞失衡與乙型肝炎的慢性化有關(guān)[2]。

本研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者存在Th1/Th2平衡失調(diào)，Th2細(xì)胞因子增多，Th1細(xì)胞因子減少，免疫狀態(tài)由Th1向Th2“克隆漂移”，這是造成HBV持續(xù)感染的主要原因。另外研究還發(fā)現(xiàn)，拉米夫定既能抑制HBV-DNA復(fù)制，又能調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子比例平衡，使免疫反應(yīng)由Th2型向Th1型逆轉(zhuǎn)。其作用機(jī)制可能是，拉米夫定可促進(jìn)Th1細(xì)胞發(fā)育，抑制Th2細(xì)胞發(fā)育，進(jìn)而促進(jìn)IFN-γ等Th1細(xì)胞因子的分泌，抑制IL-4等Th2細(xì)胞因子的分泌，提高細(xì)胞免疫反應(yīng)，抑制體液免疫反應(yīng)，增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的活性，從而清除細(xì)胞內(nèi)病毒，降低血清HBV-DNA的含量。

肝纖維化是許多慢性肝病的共同病理特征。其實(shí)質(zhì)是肝臟的損傷與愈合反應(yīng)過(guò)程，結(jié)果是肝臟的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的產(chǎn)生超過(guò)其降解，從而使過(guò)多的ECM沉積于肝臟組織，導(dǎo)致肝臟正常結(jié)構(gòu)的破壞、重構(gòu)及肝功能的損傷[8]。反映肝細(xì)胞ECM代謝的血清學(xué)指標(biāo)有HA，LN，PCⅢ，Ⅳ-C等。近年來(lái)對(duì)肝組織學(xué)和血清肝纖維化指標(biāo)相關(guān)性的研究結(jié)果表明，血清肝纖維化指標(biāo)和肝組織纖維化程度有良好的相關(guān)性，并與肝組織纖維化發(fā)展的階段性一致[9]。因此，檢測(cè)血清肝纖維化指標(biāo)ECM產(chǎn)物的含量可客觀地推測(cè)肝細(xì)胞損傷及纖維化程度。本研究結(jié)果提示，拉米夫定能抑制肝內(nèi)ECM和膠原的合成，對(duì)肝纖維化有一定療效，與胡冰等[10]的報(bào)道一致。

綜上所述，慢性乙型肝炎患者存在Th1/Th2平衡失調(diào)，拉米夫定通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的平衡，可有效抑制HBV的復(fù)制，降低患者血清中肝纖維化指標(biāo)的水平，從而達(dá)到清除細(xì)胞內(nèi)病毒、防治肝纖維化的目的。

[1]Jiang R，F(xiàn)eng X，Guo Y，et al.T helper cells in patients with chronic hepatitis B virus infection[J].Chin Med J(Engl)，2002，115(3):422-424.

[2]Priimiagi LS，Tefanova VT，Tallo TG，et al.Immune-regulating Th1-and Th2-cytokines in chronic infections caused by hepatitis B and C viruses[J].Vopr Virusol，2003，48(4):37-40.

[3]何登明，毛 青.拉米夫定治療對(duì)漫性乙型肝炎患者Th1/Th2平衡的影響及意義[J].中華肝臟病雜志，2004，12(8):495-496.

[4]中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì).病毒性肝炎防治方案[J].中華肝臟病雜志，2000，8(5):342.

[5]Boni C，Penna A，Ogg GS，et al.Lamivudine treatment can overcome totoxic T-cell hyporesponsiveness in chronic hepatitis B:new perspectives for immune therapy[J].Hepatology，2001，33(4):963-971.

[6]徐立新.拉米夫定治療慢性乙型肝炎T細(xì)胞亞群及血清HA、TGF-β1的變化[J].臨床肝膽病雜志，2008，24(2):911-912.

[7]Beckebaum S，Cicinnati VR，Zhang X，et al.Hepatitis B virus-induced defect of monocyte-derived dendritic cells leads to impaired T helper type1 response in vitro:mechanismsforviralimmune escape[J].Immunology，2003，109(4):487-495.

[8]王吉耀.重視肝纖維化的基礎(chǔ)與臨床研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2005，85(15):1 009-1 010.

[9]薛愛(ài)玲，胡益民，高宗玲.病毒性肝炎病人血清纖維化標(biāo)志檢測(cè)及其意義[J].中國(guó)基層醫(yī)藥，2004，11(4):453-454.

[10]胡 冰，劉春玲.拉米夫定治療慢性乙型肝炎對(duì)肝纖維化指標(biāo)的影響[J].中華傳染病雜志，2003，21(1):62-63.