胡 磊，左 鵬，葉邦策

（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海200237）

微珠芯片免疫法對肉制品中萊克多巴胺殘留的檢測*

胡 磊，左 鵬，葉邦策

（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海200237）

構(gòu)建了一個基于功能化微珠表面競爭性免疫反應(yīng)的流控芯片體系，在環(huán)氧化微珠表面固定小分子萊克多巴胺的蛋白全抗原，然后依次與一抗和攜帶熒光的二抗反應(yīng)，最后輸出熒光信號。在檢測中，采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法，先利用標(biāo)準(zhǔn)品制作競爭性免疫反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后進行實際樣本檢測。該系統(tǒng)檢測的萊克多巴胺的最低檢測限達到0.03 μg/L，檢測時間不超過45 min。

微珠芯片；環(huán)氧化；萊克多巴胺；獸藥殘留；最低檢測限

萊克多巴胺（Ractopamine Hydrochloride，RA C），屬β-腎上腺素興奮劑（β-興奮劑）類藥物中的苯乙醇類衍生物，是通常所說的瘦肉精，具有顯著提高胴體瘦肉率，改善動物飼料利用效率的生產(chǎn)性能。萊克多巴胺也能提高飼喂動物的瘦肉率，但因其危害大，我國已禁止使用[1]。畜禽飼喂萊克多巴胺對動物和人都會產(chǎn)生危害，對動物的危害表現(xiàn)在長期使用后易引發(fā)肌肉震顫，四肢和面部肌肉最明顯，對人危害表現(xiàn)為人吃了殘留有萊克多巴胺的組織后可能會出現(xiàn)中毒癥狀，通常表現(xiàn)為面色潮紅、頭暈、心悸、四肢麻木等不良反應(yīng)，對有心血管病的患者危害更大，嚴(yán)重的危及生命，我國已嚴(yán)禁在飼料中添加使用[2]，并且世界各國都在積極開發(fā)檢測萊克多巴胺的辦法。

目前檢測萊克多巴胺的方法主要有高效液相色譜法，毛細管電泳法，酶聯(lián)免疫法等等，雖然檢測方法多種多樣，但普遍存在檢測儀器昂貴，操作繁瑣等缺點，為此采用了一種新的生物芯片法-微珠芯片法來進行檢測分析。近年來，生物芯片作為一種新型的生物材料和實驗方法得到了廣泛的應(yīng)用[3]，生物芯片有多種形式，包括微陣列芯片和微流控芯片，本文研究的是一種類似于微流控的微珠載體芯片，這種基于競爭免疫反應(yīng)原理的微珠載體芯片測定方法具有靈敏度高、特異性強、通量高、試劑用量少等諸多優(yōu)點[4]。作者通過對蛋白全抗原的有效固定，并采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法進行測定，該方法簡單、快速、高效，靈敏度高且廉價，適合萊克多巴胺的大規(guī)模檢測。

1 實驗部分

1.1 實驗裝置

微珠芯片在線檢測系統(tǒng)如圖1所示，本系統(tǒng)包括蠕動泵，微珠芯片，六通閥，以及相關(guān)管路，其中中間的六通閥為樞紐控制整個免疫檢測過程，圖1中2種狀態(tài)分別顯示洗滌，進樣圖1（a）和循環(huán)反應(yīng)圖1（b）。

圖1 實驗裝置示意圖Fig.1 Schematic of setup

1.2 試劑和儀器

Tweem 20；1，4-丁二醇二縮水甘油醚,美國Sigma公司；小牛血清白蛋白，美國Sigma公司；萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，二氧化硅微珠，氨基顯色劑TNBS，萊克多巴胺單克隆抗體，美國Biodesign公司；Cy5/Cy3標(biāo)記羊抗鼠IgG，美國Rockland公司；3-氨丙基三甲氧基硅烷APTMS，美國Sigma公司；pH試紙，考馬斯亮藍250。

Milli-Q型超純水系統(tǒng)，美國Millipore公司；真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；管式流動芯片分析儀；Centrifnge 5415R型冷凍離心機，德國Eppe ndorf公司；臺式恒溫振蕩器，上海精宏儀器設(shè)備有限公司；G-560E型漩渦混勻儀，美國Scientific indu stries公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏儀器設(shè)備有限公司，Genepix掃描儀，基因公司。

1.3 檢測原理

本實驗是基于競爭免疫反應(yīng)的原理實現(xiàn)的，在免疫反應(yīng)中，抗體可以和對應(yīng)抗原特異性結(jié)合，而抗抗體（二抗）又可以抗體結(jié)合，本實驗將所測物質(zhì)作為抗原固定在玻璃微珠載體上，然后將待檢物和對應(yīng)抗體混合液同微珠上固定的抗原探針反應(yīng)，這時，溶液中抗原（待檢物）和微珠表面上抗原就會競爭結(jié)合溶液中的相應(yīng)抗體，洗滌后，加入熒光標(biāo)記二抗會同已在微珠表面共價結(jié)合的抗體結(jié)合，而通過掃描就可以捕捉到已結(jié)合的熒光信號，就可以表征一抗和微珠上抗原探針的結(jié)合程度，用抗原標(biāo)準(zhǔn)品和探針競爭的方式可以得到此免疫競爭的標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以對照得到同樣條件競爭反應(yīng)的實際樣本濃度。

1.4 微珠表面修飾策略

1.4.1 微珠表面的化學(xué)修飾

（1）二氧化硅微珠的羥基化修飾

用1.5 mL離心管稱量100 mg二氧化硅裸珠，用去離子水洗凈，加入1 mL6 mol/LHCl，37℃振蕩反應(yīng)過夜，然后用去離子水洗滌至中型，110℃真空干燥過夜。

（2）二氧化硅微珠的硅烷化修飾

氨基硅烷化，具體操作是：羥基化珠干燥完成后，加入含2%的2，3-氨丙基三甲氧基硅烷甲苯溶液，反應(yīng)5 h,然后110℃真空干燥2 h，用TNBS顯色劑檢驗其反應(yīng)效果，保存待用，此珠稱為氨基珠。

（3）二氧化硅微珠的功能化修飾

通過系列實驗發(fā)現(xiàn)，在氨基硅烷化基礎(chǔ)上進行環(huán)氧化，可以有效固定小分子的牛血清蛋白全抗原環(huán)氧化,在500 μL 1，4-丁二醇二縮水甘油醚（butane-1，4-diol diglyciydyl ether）的 PBS（pH 7.4）緩沖液中加入10 mg氨基珠，37℃反應(yīng)16 h，用PBS（pH 7.4）緩沖液洗滌3遍，無水乙醇洗滌1遍，常溫真空干燥。

1.4.2 間接熒光免疫實驗法過程

（1）固定探針

將功能化修飾微珠與萊克多巴胺的蛋白BSA的偶聯(lián)物混合在37℃反應(yīng)過夜，之后用PBST，PBS各洗滌2遍。

（2）抗體抗原反應(yīng)

將微珠在蠕動泵的作用下，泵入毛細管，然后用1 mL PBST和1 mL PBS導(dǎo)入管中進行洗滌，洗滌完成后，導(dǎo)入適量濃度的一抗和標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）混合溶液50 μL，此時恰好將整個管路充滿，然后將橡膠管兩頭連接，使之在加熱板的恒溫環(huán)境下循環(huán)流動反應(yīng)，20 min后，再用1 mL PBST和1 mL PBS導(dǎo)入管中進行洗滌。

（3）抗體二抗反應(yīng)

洗滌完成后，導(dǎo)入50 μL標(biāo)記熒光的二抗，同一抗反應(yīng)過程步驟，進行恒溫封閉循環(huán)反應(yīng)，20 min后，再用1 mLPBST和1 mLPBS導(dǎo)入管中進行洗滌。

（4）信號獲取及數(shù)據(jù)處理

洗滌完后使用Genepix掃描儀進行掃描，并分析圖形及進行數(shù)據(jù)處理。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用間接競爭法繪制小分子競爭濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用6條攜帶6組固定好該探針微珠的毛細管的橡膠管路，分別導(dǎo)入15 μL稀釋度為1︰100的單克隆抗體（1 mg/mL）和15 μL濃度（μg/L）分別為0，0.01，0.1，1，10，100標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣。然后按

1.4.2方法進行分析,最后得到經(jīng)過6點梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過不斷優(yōu)化改變單抗?jié)舛?，以期得到競爭性強的?biāo)準(zhǔn)曲線。優(yōu)化完成后，確定最低檢測限，各取檢測區(qū)間內(nèi)兩點做加標(biāo)回收率測定。

1.4.4 實際樣本檢測

實際樣本檢測：對于每一種實際樣本用固定有萊克多巴胺抗原的微珠進行檢視，反應(yīng)流程與上述檢測方法相同，同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，實際樣本得到的信號與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較，反應(yīng)完成后，可即時得到樣本里各種殘留的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 微珠表面修飾策略

2.2 一抗、羊抗鼠IgG二抗反應(yīng)時間優(yōu)化

評價檢測方法的重要方面是檢測時間，所以有必要對2次免疫反應(yīng)進行一系列的優(yōu)化，首先就是對反應(yīng)時間的優(yōu)化，一抗反應(yīng)時間和二抗反應(yīng)時間的優(yōu)化，設(shè)置了一組時間梯度5，10，15，20，30 min來進行一抗反應(yīng)時間優(yōu)化，圖2信號圖是反應(yīng)結(jié)果。

從圖2可以看出，一抗反應(yīng)在15 min，二抗反應(yīng)在10 min時反應(yīng)信號分別進入平臺期，所以可確定優(yōu)化結(jié)果一抗反應(yīng)15 min，二抗反應(yīng)10 min，反應(yīng)中洗滌，加樣等時間需要20 min，所以本系統(tǒng)-微珠芯片多元檢測總體需要45 min時間。圖中對全抗原的濃度進行梯度稀釋，發(fā)現(xiàn)RAC-BSA為7.06 mg/mL時，為其2倍稀釋下限，為有明顯信號的最低濃度，為節(jié)約原則，選取這一濃度點為實驗濃度。

圖2 免疫反應(yīng)時間優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimizationresults of Immune reactiontime

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和回收率測定

2.3.1 一抗?jié)舛葍?yōu)化

在標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)化過程中，一抗?jié)舛仁且粋€關(guān)鍵指標(biāo)，因為它決定免疫競爭反應(yīng)的競爭性，一抗?jié)舛葷舛热绻?，探針結(jié)合量小，則普遍信號就比較微弱，一抗?jié)舛热绻?，所有探針都被飽和結(jié)合，普遍信號就比較強，也沒有強烈的競爭反應(yīng)趨勢，所以合適的一抗?jié)舛葢?yīng)該是讓探針與標(biāo)準(zhǔn)品有一個充分競爭反應(yīng)效果，表現(xiàn)是在標(biāo)準(zhǔn)曲線上有一個明顯的競爭下降趨勢。以萊克多巴胺為例，講述其優(yōu)化過程：

標(biāo)準(zhǔn)曲線條件的優(yōu)化主要是其一抗?jié)舛鹊膬?yōu)化，其濃度高時，結(jié)合位點被飽和，信號普遍較高，競爭性較弱，隨著一抗?jié)舛认陆担盘柦档偷耐瑫r，競爭性也在加強，當(dāng)Rac一抗?jié)舛葹?.75 μg/mL時，競爭性最好，在0.01～1.00 μg/L上有明顯的下降趨勢，但一抗進一步稀釋時，信號普遍明顯降低，競爭性有趨緩，根據(jù)實驗要求，需要較強的競爭性，所以選9.5 μg/mL為最佳一抗反應(yīng)濃度，在此條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3。

圖3 萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Calibrationcurve of clenbuterol

完成優(yōu)化之后，就可以按照確定的優(yōu)化結(jié)果進行微珠芯片實時檢測的實驗，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時檢測實際樣本，實現(xiàn)高效檢測。

2.3.2 回收率測定

測定加標(biāo)回收率是評價任何一種檢測方法的必要程序，根據(jù)萊克多巴胺的檢測區(qū)間取2個濃度點進行加標(biāo)回收的測定，各平行測定5個樣，并測定其平均回收率和測定數(shù)據(jù)的離散程度CV，見表1。并利用3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的計算方法確定最低檢測限，為0.03 μg/L，檢測范圍為0.04～1.00 μg/L，IC50為0.76 μg/L。

表1 萊克多巴胺加標(biāo)回收測定Table 1 Determinationof standardadditionrecovery of ractopamine

2.3.3 實際樣品檢測

用微珠芯片分析平臺對來自豬肉和豬肝的100個樣品做了萊克多巴胺的殘留檢測，結(jié)果陽性符合率為100%，陰性符合率為98.4%。

3 結(jié)論

在環(huán)氧化微珠表面固定了小分子萊克多巴胺的蛋白全抗原，并采用基于此的微珠芯片實時檢測平臺，實現(xiàn)了對萊克多巴胺的在線檢測，最低檢測限達到0.04 μg/L，檢測范圍為0.04～1.00 μg/L，并且1次檢測時間不超過45 min。該系統(tǒng)靈敏、準(zhǔn)確、廉價，所以適宜大規(guī)模檢測的初篩實驗，并能在食品檢測中發(fā)揮作用。

[1]Prest，J.E.Determination of metal cations on miniaturised planar polymeric separationdevices using isotachophoresis withintegrated conductivity detection[J].Analyst，2001,126（4）：433-437.

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[3]Kurita，R.On-chip enzyme immunoassay of a cardiac markerusing a microfluidic device combined with a portable surface plasmon resonance system[J].Anal Chem，2006，78（15）：5525-5531.

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Detection of Ractopamine Residue in Meat Product by Microbead Biochip Based on Immunization

HU Lei，ZUOPeng，YEBang-ce
（School of Biotechnology，EastChinaUniversity of Science andTechnology，Shanghai 200237，China）

A kind of fluidic biochip based on competitive immunoreaction occurred on the funcational bead was constructed，the holoantigenof small molecularractopamine was immobilized on the epoxy-modified beads，then it reacted with the primary antibody and secondary antibody in turn.At last，signal was outputted.The internal standard-calibration curve method was used in detection，a calibration curve of competitive immunoreaction was made by using the standard sample before detecting actual samples，then detection of actual samples was carried out.The LOD（limit of detection）reached0.03 μg/L，detectiontime was less than45 min.

Microbeadbiochip；Epoxidation；Ractopamine；Drug residue；Limitof detection

O658

A

1671-0460（2010）04-0481-04

2010-06-28

胡 磊（1987-），男，湖北荊州人，碩士研究生，主要從事生物芯片研究。E-mail：hl3632086@163.com。