高麗麗,劉佳,朱文眾

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊,050018)

酸根離子對(duì)丙酮-丁醇清液發(fā)酵的影響

高麗麗,劉佳,朱文眾

(河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,河北石家莊,050018)

研究了酸根離子對(duì)以玉米淀粉為碳源進(jìn)行丙酮-丁醇清液發(fā)酵時(shí)的影響規(guī)律。結(jié)果表明:抑制作用最強(qiáng),且隨該離子濃度的增加而增強(qiáng)。相對(duì)應(yīng)的鈉鹽、銨鹽質(zhì)量濃度在0.2～1.0 g/L發(fā)酵正常,其中溶劑產(chǎn)量最高達(dá)到22.091 g/L,選擇合適的濃度能起到一定的促進(jìn)作用。,Cl-對(duì)應(yīng)鹽質(zhì)量濃度增加到2.0 g/L時(shí),溶劑產(chǎn)量有所下降,另外3種酸根離子的影響作用不大。幾種營(yíng)養(yǎng)鹽混合,在不同質(zhì)量濃度下進(jìn)行發(fā)酵,未添加亞硫酸鹽的發(fā)酵正常,添加亞硫酸鹽的發(fā)酵出現(xiàn)異常,溶劑產(chǎn)量很低,僅為1.806 g/L,同樣說(shuō)明對(duì)丙酮-丁醇發(fā)酵具有強(qiáng)抑制作用。

酸根離子,丙酮-丁醇發(fā)酵,清液,玉米淀粉

丙酮-丁醇發(fā)酵是一項(xiàng)傳統(tǒng)的大宗發(fā)酵,歷史悠久,被認(rèn)為是轉(zhuǎn)化生物量為有價(jià)值化合物的最有前途的途徑之一[1-2]。由丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)發(fā)酵產(chǎn)生的丁醇、丙酮、乙醇統(tǒng)稱為丙丁總?cè)軇?它是重要的基本有機(jī)化工原料,除直接用作溶劑外,還有許多用途[3]。

丙酮、丁醇生產(chǎn)一般利用丙酮丁醇梭菌,在厭氧條件下利用淀粉或糖發(fā)酵生成丙酮、丁醇及少量乙醇等溶劑。絕大多數(shù)廠家采用玉米或甘薯等淀粉質(zhì)原料進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵液黏度高,易造成設(shè)備堵塞,污染大[4]。原料利用的不充分,導(dǎo)致污水處理成本巨大,發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量低這一直制約著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。據(jù)報(bào)道,在酒精生產(chǎn)中,采用清液發(fā)酵,大大優(yōu)化了酒精的發(fā)酵工藝,對(duì)原料、水、能源得到全方位的利用,取得了較高的經(jīng)濟(jì)效益[5]。清液發(fā)酵即對(duì)原料進(jìn)行綜合加工,對(duì)發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)成分充分利用,達(dá)到發(fā)酵液澄清,進(jìn)而可循環(huán)使用,輔助于把發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)回收利用,進(jìn)行再生產(chǎn)。采用清液發(fā)酵具有諸多優(yōu)點(diǎn),例如,便于發(fā)酵新技術(shù)的應(yīng)用,改善裝置運(yùn)行狀況,發(fā)酵液可循環(huán)利用,從而實(shí)現(xiàn)節(jié)能減排等[6]。

試驗(yàn)中配制半合成培養(yǎng)基進(jìn)行清液發(fā)酵,添加營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)發(fā)酵有顯著影響,但是半合成培養(yǎng)基成分復(fù)雜,且溶劑產(chǎn)量不高。所以采用玉米淀粉為碳源添加玉米漿進(jìn)行發(fā)酵,驗(yàn)證能否充分利用淀粉從而實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液澄清,但得到的發(fā)酵結(jié)果不理想,有大量殘余淀粉,溶劑產(chǎn)量約為2 g/L。進(jìn)一步以玉米淀粉為碳源,采用玉米粉浸泡液配制培養(yǎng)基,發(fā)酵結(jié)果正常,溶劑產(chǎn)量可達(dá)21.632 g/L,與以玉米粉為原料的溶劑產(chǎn)量相當(dāng)。玉米漿與玉米粉浸泡液兩者區(qū)別主要在于后者浸泡過(guò)程中未添加亞硫酸,從而使發(fā)酵得到的溶劑產(chǎn)量相差很多。SO2對(duì)部分酵母及細(xì)菌發(fā)酵有抑制作用[7],然而及其他酸根離子對(duì)丙酮丁醇梭菌發(fā)酵有無(wú)影響仍未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 菌種

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)CICC 8011,購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 原料

玉米淀粉,玉米粉(市售)。

1.3 主要儀器

Agilent 6820氣相色譜儀,安捷倫科技有限公司;S W-CJ-2FD潔凈工作臺(tái),蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;LRH-150B生化培養(yǎng)箱,廣東省醫(yī)療器械廠。

1.4 工藝流程

將玉米粉加去離子水浸泡24 h后過(guò)濾,得到的濾液用于配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的玉米淀粉醪液,經(jīng)糊化30 min后分裝滅菌,每支試管裝液20 mL,待冷卻后按10%的接種量接種,然后放入真空干燥器中抽真空后進(jìn)行厭氧發(fā)酵,溫度控制在37°C左右,發(fā)酵72h后結(jié)束,用氣相色譜儀對(duì)發(fā)酵液中的丙酮、丁醇、乙醇的產(chǎn)量進(jìn)行檢測(cè)。

玉米粉浸泡過(guò)程中,其中的水溶性物質(zhì)被浸泡出來(lái),浸泡液用于配制玉米淀粉培養(yǎng)基。玉米粉浸泡液與玉米漿的最大區(qū)別在于玉米漿中含有SO2,而以玉米淀粉為原料添加玉米漿進(jìn)行丙丁發(fā)酵時(shí),發(fā)酵受到抑制,考慮到SO2對(duì)一些細(xì)菌有抑制作用,可能對(duì)丙酮丁醇梭菌也具有抑制作用。另外,用去離子水配制玉米淀粉培養(yǎng)基,由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足,發(fā)酵失敗。所以試驗(yàn)采用玉米粉浸泡液配制玉米淀粉培養(yǎng)基,使玉米淀粉被充分利用,從而實(shí)現(xiàn)清液發(fā)酵。

1.5 分析方法

1.5.1 產(chǎn)物測(cè)定

將發(fā)酵液倒入5 mL的離心管中離心(9000 r/min,10 min),取1 mL上清液,加入4 mL內(nèi)標(biāo)液,充分搖勻。進(jìn)樣1.0μL進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱為HP-INNOWAX(19091N-236)毛細(xì)管色譜柱(60 m×0.251 mm×0.50μm);檢測(cè)器為FID;進(jìn)樣溫度180°C;檢測(cè)溫度220°C;柱溫初始溫度70°C,保持1 min后以20°C/min的速率升至130°C,保持1 min后以10°C/min的速率升至170°C,保持1 min后,以5°C/min的速率升至190°C,保持2 min,總運(yùn)行時(shí)間為16 min;載氣為氮?dú)?0 mL/min;柱流速1 mL/min;氫氣30 mL/min;空氣300 mL/min;進(jìn)樣量:1.0μL;分流比:90∶1;定性、定量方法:以保留時(shí)間定性;內(nèi)標(biāo)法定量,內(nèi)標(biāo)物為異丁醇。

1.5.2 殘余淀粉測(cè)定

離心除去清液,在105℃下烘至恒重,稱量。

2 結(jié)果與討論

2.1 以玉米粉浸泡液代替去離子水進(jìn)行丙酮-丁醇發(fā)酵

將玉米粉加去離子水于冰箱中浸泡24 h,適當(dāng)攪拌,過(guò)濾后代替去離子水配制培養(yǎng)基進(jìn)行丙酮-丁醇發(fā)酵。分別采用0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 g/L的玉米粉濃度進(jìn)行浸泡,用過(guò)濾后的浸泡液配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的玉米淀粉醪液進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)果見圖1。

由圖1可見,隨著玉米粉浸泡濃度的增加,溶劑產(chǎn)量先是明顯增加,然后基本保持不變。從溶劑產(chǎn)量和節(jié)省原料方面考慮,采用2.0g/L的質(zhì)量濃度浸泡較佳,總?cè)軇┊a(chǎn)量達(dá)到21.632 g/L,已經(jīng)達(dá)到采用玉米粉為原料發(fā)酵的溶劑產(chǎn)量。

2.2 幾種常見酸根離子的鈉鹽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

為了研究酸根離子對(duì)丙酮-丁醇發(fā)酵的影響,首先選擇了幾種常見酸根離子的鈉鹽,分別在0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0 g/L的質(zhì)量濃度下進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)果見圖2。

圖1 不同玉米粉浸泡濃度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

圖2 不同質(zhì)量濃度下幾種鈉鹽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

由圖2可見,在Na2SO4,Na2CO3,NaAC,Na3PO4的各個(gè)濃度下發(fā)酵總?cè)軇┊a(chǎn)量均在20 g/L以上,最高溶劑產(chǎn)量可達(dá)到22g/L左右,對(duì)發(fā)酵有一定的促進(jìn)作用。NaCl質(zhì)量濃度在0.2～1.0 g/L,發(fā)酵正常,但是在2.0 g/L的條件下,溶劑產(chǎn)量?jī)H為12.175 g/L,影響了發(fā)酵的正常進(jìn)行。添加Na2SO3發(fā)酵出現(xiàn)異常,質(zhì)量濃度在0.2 g/L的條件下,溶劑產(chǎn)量為3.947 g/L,并且隨著質(zhì)量濃度地增加溶劑產(chǎn)量降低,在2.0 g/L的質(zhì)量濃度下,溶劑產(chǎn)量?jī)H為1.558 g/L,很大程度地抑制了發(fā)酵。

2.3 添加幾種常見酸根離子的銨鹽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

考慮到Na+對(duì)丙酮-丁醇發(fā)酵可能也會(huì)有影響,所以又選擇相對(duì)應(yīng)的幾種銨鹽,也分別在0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,2.0 g/L的濃度下進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)果見圖3。

由圖3可見,銨鹽與鈉鹽的發(fā)酵總?cè)軇┳兓€基本一致。在 0.2～1.0 g/L的質(zhì)量濃度內(nèi),(NH4)2SO4,NH4Cl,(NH4)2CO3,NH4Ac,(NH4)3PO4發(fā)酵正常,溶劑產(chǎn)量均在 20 g/L以上,只有(NH4)2SO4在1.0 g/L的質(zhì)量濃度下溶劑產(chǎn)量為19.846 g/L,略有下降。合適濃度的以上幾種銨鹽也使產(chǎn)量有所提高,起到了促進(jìn)作用。(NH4)2CO3,NH4Ac,(NH4)3PO4在2.0 g/L質(zhì)量濃度下發(fā)酵正常,(NH4)2SO4,NH4Cl在此質(zhì)量濃度下產(chǎn)量降低,分別為13.994 g/L和16.091 g/L。添加(NH4)2SO3與添加Na2SO3變化曲線一致,也出現(xiàn)了發(fā)酵異常。質(zhì)量濃度為0.2 g/L時(shí)產(chǎn)量為3.408 g/L,隨著濃度增加溶劑產(chǎn)量降低,2.0 g/L質(zhì)量濃度下(NH4)2SO3溶劑產(chǎn)量?jī)H1.436 g/L,抑制了發(fā)酵。

圖3 不同質(zhì)量濃度下幾種銨鹽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

2.4 幾種鈉鹽和銨鹽分別混合在不同濃度下對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

一般幾種營(yíng)養(yǎng)鹽都是混合加入培養(yǎng)基,共同發(fā)揮作用。因此試驗(yàn)中又分別把幾種鈉鹽和銨鹽混合在不同的質(zhì)量濃度下進(jìn)行發(fā)酵?？紤]到亞硫酸鹽對(duì)發(fā)酵有很大的抑制作用,所以又除 Na2SO3和(NH4)2SO3之外將其他幾種鈉鹽和銨鹽分別按不同質(zhì)量濃度混合進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵結(jié)果見圖4。

圖4 各種鹽混合在不同質(zhì)量濃度下對(duì)發(fā)酵產(chǎn)量的影響

由圖4可見,幾種鹽混合,不添加亞硫酸鹽的情況下,發(fā)酵正常,最高產(chǎn)率達(dá)到22.050 g/L,起到了促進(jìn)作用;添加亞硫酸鹽的發(fā)酵出現(xiàn)異常,且亞硫酸鹽濃度越大抑制作用越明顯,對(duì)發(fā)酵的影響很大。

2.5 各鈉鹽在不同質(zhì)量濃度下的淀粉轉(zhuǎn)化率

添加鈉鹽與添加銨鹽的發(fā)酵結(jié)果基本一致,選擇添加不同鈉鹽的條件下計(jì)算淀粉轉(zhuǎn)化率,見圖5。

圖5 各鈉鹽在不同質(zhì)量濃度下的淀粉轉(zhuǎn)化率

由圖5可見,添加Na2SO4,Na2CO3,NaAC,Na3PO4發(fā)酵正常,淀粉轉(zhuǎn)化率在30%左右,NaCl質(zhì)量濃度在2.0 g/L的條件下,淀粉轉(zhuǎn)化率為16.17%,部分淀粉剩余。添加Na2SO3發(fā)酵出現(xiàn)異常,淀粉轉(zhuǎn)化率很低,大量淀粉剩余,在2.0 g/L的質(zhì)量濃度下,淀粉轉(zhuǎn)化率僅為2.18%,而丙丁發(fā)酵的理論淀粉轉(zhuǎn)化率為39.2%。從淀粉轉(zhuǎn)化率上同樣看出SO32-對(duì)丙丁發(fā)酵有很強(qiáng)的抑制作用。

3 結(jié)論

經(jīng)多次試驗(yàn),以玉米淀粉為原料,采用玉米粉浸泡液配制培養(yǎng)基進(jìn)行清液發(fā)酵,溶劑產(chǎn)量可達(dá)到21.632 g/L。試驗(yàn)中研究了酸根離子對(duì)以玉米淀粉為原料的丙酮-丁醇清液發(fā)酵的影響。結(jié)果表明:有很強(qiáng)的抑制作用,且隨其濃度的增加而增強(qiáng)。對(duì)應(yīng)鹽質(zhì)量濃度在0.2～1.0 g/L,發(fā)酵基本正常,溶劑產(chǎn)量均在20 g/L以上,最高達(dá)到22.091 g/L,在濃度合適的情況下,這些酸根離子起到了一定的促進(jìn)作用。當(dāng)各營(yíng)養(yǎng)鹽質(zhì)量濃度增加到2.0 g/L時(shí),,Cl-對(duì)應(yīng)的溶劑產(chǎn)量有所下降,另外3種酸根離子影響不大。幾種營(yíng)養(yǎng)鹽混合進(jìn)行發(fā)酵,未添加亞硫酸鹽的發(fā)酵正常,添加亞硫酸鹽的發(fā)酵出現(xiàn)異常,最低僅為1.806 g/L,同樣說(shuō)明對(duì)丙酮-丁醇發(fā)酵的強(qiáng)抑制作用。在釀造酒工藝中,SO2的應(yīng)用廣泛,它能夠抑制各種微生物的繁殖、發(fā)酵。微生物抵抗SO2的能力不一樣,細(xì)菌最為敏感[8]。試驗(yàn)得出,對(duì)丙酮丁醇梭菌也有很強(qiáng)的抑制作用。由此判斷,添加玉米漿發(fā)酵溶劑產(chǎn)量低,主要原因應(yīng)該是的影響,可以進(jìn)一步試驗(yàn)去除玉米漿中的,研究以玉米淀粉為碳源添加玉米漿進(jìn)行發(fā)酵,提高溶劑產(chǎn)量,實(shí)現(xiàn)清液發(fā)酵。

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ABSTRACTThe clear liquid fermentation hasmany advantages.This paper studies the influential patterns of acid ion on Acetone-butanol clear liquid fermentation with corn starch as carbon source.The results showed that:has the strongest inhibitory ability,and this ability enhances with increasing ion concentration.The fermentation is normalwhen the corresponding concentration of sodium salt,ammonium salt tois in the range of 0.2～1.0 g/L.The highest yield achieved was 22.091g/L.The appropriate concentration can play a certain enzymatic effect.When the concentration corresponding salt of,Cl-increase to 2.0 g/L,the solvent production declined slightly,and there was little effect of the other three acid ion.Mixture of several kinds of salt in the fer mentation at varies concentrations proved that the fermentation was normalwith no sulfite,and itwas abnormal with sulfite,where the solventproductionwas as as1.806g/L.Similarly,strong inhibitory action of SO32-wasproved on the fer mentation.

Key wordsacid ion,Acetone-butanol fermentation,clear liquid,corn starch

Effects of Acid Ion on Acetone-butanol Clear L iquid Fermentation

Gao Li-li,Liu Jia,ZhuWen-zhong
(College of Biological Science and Engineering,HebeiUniversity of Science and Technology,Shijiazhuang 050018,China)

碩士研究生(朱文眾教授為通訊作者)。

2009-11-11,改回日期:2010-02-01