梁任繁 王益奎 李文嘉 黎 炎 吳永官

（1廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣西南寧 530007；2廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530004）

茄子ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化及驗(yàn)證

梁任繁1，2王益奎1李文嘉1黎 炎1吳永官1

（1廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣西南寧 530007；2廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530004）

以茄子為試驗(yàn)材料，采用改良 CTAB法提取茄子嫩葉總 DNA，結(jié)合單因素設(shè)計和正交設(shè)計L9（34）的優(yōu)點(diǎn)，探討Mg2+、dNTP、引物及Taq DNA聚合酶等因素對茄子ISSR-PCR反應(yīng)體系的影響，利用16份廣西茄子主要栽培品種對最優(yōu)處理組合進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，在25 μL反應(yīng)體系中，含2.5 μL10×buffer、2.0～3.0 mmol·L-1Mg2+、0.32～0.36 mmol·L-1dNTP、0.4 μmol·L-1引物、50 ng 模板 DNA、0.6 U Taq DNA聚合酶等成分，可以獲得比較穩(wěn)定、清晰和豐富的條帶。

茄子；優(yōu)化；ISSR；驗(yàn)證

茄子（Solanum melongena L.）是我國栽培較廣的茄果類蔬菜之一，目前在生產(chǎn)上推廣種植的品種很多，但品種間形態(tài)差異較小，同物異名、同名異物現(xiàn)象非常嚴(yán)重，亟須進(jìn)行科學(xué)鑒定研究。簡單序列重復(fù)間擴(kuò)增多態(tài)性（Inter-Simple Sequence Repeats，ISSR）是Zietkiewicz等于1994年在SSR基礎(chǔ)上建立起來的新型分子標(biāo)記技術(shù)（陳大霞 等，2006），近幾年在苦瓜（王緒 等，2007）、辣椒（楊若林 等，2005）等作物上得到了廣泛應(yīng)用。

ISSR作為基于PCR的一種分子標(biāo)記，易受Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA等因素的干擾，其最佳擴(kuò)增條件在不同物種可能有所不同（Yu et al.，2006）。目前，在眾多的ISSR優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，研究者多采用單因素試驗(yàn)，雖然優(yōu)化的結(jié)果比較明確簡潔，但容易忽視各個因素之間的交互作用；相反正交設(shè)計可彌補(bǔ)上述的不足，它具有均衡分散和整齊可比的特點(diǎn)，能通過有限的試驗(yàn)找出最佳組合條件；而且有關(guān)茄子ISSR反應(yīng)體系優(yōu)化的研究目前報道不多。

本試驗(yàn)結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)兩個方案的優(yōu)點(diǎn)，對茄子 ISSR反應(yīng)體系進(jìn)行全面優(yōu)化和實(shí)際驗(yàn)證，旨在建立一個可靠性和重復(fù)性都比較高的反應(yīng)體系，為我國茄子種質(zhì)的分子鑒定、遺傳多樣性等研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試茄子材料共16份，收集自廣西各地主要栽培品種（表1）。茄子種子經(jīng)催芽育苗后，2010年2月16日定植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所試驗(yàn)基地。在5～6葉期，分批次采剪植株新鮮幼嫩葉片，在低溫條件下帶回實(shí)驗(yàn)室，用70 %乙醇清洗表面，用無菌去離子水沖洗干凈，再用潔凈濾紙吸干后提取總DNA。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與純化 采用改良的CTAB法提取基因組總DNA（杜黎明 等，2007），用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量（圖1），DNA的純度和濃度用Eppendorf Biophotometer濃度電度測定儀測定OD值，并將其濃度統(tǒng)一稀釋為50 ng·μL-1，保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.2.2 單因素優(yōu)化方案 采用單因素試驗(yàn)，對影響擴(kuò)增的dNTP、Mg2+設(shè)置了10個不同梯度處理（表2），其他參數(shù)見基本反應(yīng)體系。

1.2.3 互作效應(yīng)的優(yōu)化設(shè)計及驗(yàn)證 采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計，對dNTP濃度、引物濃度、Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶濃度等進(jìn)行4個因素3個水平篩選優(yōu)化試驗(yàn)，共9個處理（表3）。再以廣西栽培的16份茄子為材料，對最佳處理進(jìn)行實(shí)際驗(yàn)證。

1.2.4 基本擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序 PCR反應(yīng)在 Bio-RAD（Icycler-PCR）上進(jìn)行。初步確定PCR反應(yīng)體系為25 μL，ISSR基本反應(yīng)體系:Taq酶（5 U·μL-1）0.4 μL、10×buffer2.5 μL（無 Mg2+）、25 mmol·L-1Mg2+2.5 μL、10 mmol·L-1dNTP1.0 μL、10 mmol·L-1引物1.0 μL、DNA模板50 ng，具體成分按不同設(shè)計方案進(jìn)行，最后用無菌超純水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)基本程序:95 ℃預(yù)變性5 min，共40個循環(huán)，每個循環(huán)95 ℃變性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸7 min，10 ℃保存。

表1 試驗(yàn)材料及來源地

圖1 DNA質(zhì)量檢測

表2 影響擴(kuò)增的主要因子

1.2.5 引物及數(shù)據(jù)處理 各試驗(yàn)方案均以ISSR827（5’-ACACACACACAC ACACG-3’）為引物，引物根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的序列設(shè)計，由上海恒因生物技術(shù)有限公司合成。其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，在5 mg·L-1EB染色10～15 min。電泳緩沖液為1.0×TAE，用DL5000 bp DNA梯度作為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物，在電場強(qiáng)度5 V·cm-1電泳15～20 min，電泳結(jié)果于Fujifilm pharmcia Biotech凝膠成像分析系統(tǒng)拍照保存。

采用0和1系統(tǒng)記錄譜帶位置，在相同遷移位置強(qiáng)重復(fù)出現(xiàn)的帶記為“1”，不重復(fù)出現(xiàn)弱帶或無帶記為“0”，利用SPSS10.0統(tǒng)計軟件對驗(yàn)證凝膠圖像進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

表3 PCR正交試驗(yàn)設(shè)計表

2.1 單因素優(yōu)化

由圖2可知，Mg2＋對擴(kuò)增的影響很大。在0～0.5 mmol·L-1間，一片模糊，基本沒有條帶；當(dāng)濃度大于1.0 mmol·L-1時，開始出現(xiàn)條帶，但條帶很弱，可隨著Mg2＋濃度增加，不斷地擴(kuò)增出較多條帶，彌散、條帶缺失等現(xiàn)象也逐漸消失，當(dāng)濃度達(dá)到3.0 mmol·L-1時，其條帶質(zhì)量達(dá)到最清晰、最穩(wěn)定，亮度最適宜，大于3.0 mmol·L-1時又逐漸出現(xiàn)條帶彌散、缺失等現(xiàn)象。因此，Mg2＋濃度為3.0 mmol·L-1時，反應(yīng)體系PCR擴(kuò)增效果最好。

由圖3可知，dNTP對擴(kuò)增的影響也很大。在0 mmol·L-1時，不能擴(kuò)增出條帶；隨著dNTP濃度增加，條帶質(zhì)量逐漸變好，直到dNTP濃度為0.36 mmol·L-1時，其條帶效果最好，大于0.36 mmol·L-1時條帶質(zhì)量又逐漸變差，直至不能擴(kuò)增出條帶。因此，本試驗(yàn) dNTP最佳濃度為0.36 mmol·L-1）。

圖2 Mg2＋對ISSR-PCR的影響

圖3 dNTP對ISSR-PCR的影響

2.2 互作效應(yīng)優(yōu)化

圖4所示，L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計的每個處理均能擴(kuò)增出條帶，但是它們在條帶數(shù)目、清晰度和彌散程度等方面有所不同。例如，第2個處理僅擴(kuò)增出1條比較弱的帶，且分子量偏低；第1、3、4處理均擴(kuò)增出3條帶，但都是弱帶；第5個處理擴(kuò)增出5條帶，但處于小分子量的帶都為偏弱帶，部分有彌散；第6個處理也擴(kuò)增出5條帶，但處于小分子量和大分子量之間的帶都為偏弱帶，部分有彌散；第7、8個處理均擴(kuò)增出6條帶，也是出現(xiàn)條帶比較多的處理，其中第7處理在小分子量或大分子量處均有清晰高亮的帶；第9個處理擴(kuò)增出的條帶最多，但只有在大分子量處有2條亮帶，其他均為弱帶且有彌散現(xiàn)象。綜上所述，第7個處理為最佳處理，其組合為:Taq（0.6 U）、Mg2+（2.0 mmol·L-1）、dNTP（0.32 mmol·L-1）、引物（0.4 μmol·L-1）。

2.3 最佳組合的驗(yàn)證

圖5為最佳處理16份茄子材料實(shí)際驗(yàn)證的電泳凝膠圖像。從圖5可知，最佳處理能夠?qū)η炎訑U(kuò)增出比較豐富、清晰和穩(wěn)定的條帶，且分子量一般都低于2000 bp。

圖4 L9（34）不同處理對ISSR-PCR的影響

? 圖5 最優(yōu)處理的驗(yàn)證

對驗(yàn)證凝膠圖像進(jìn)行多態(tài)性和系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果表明，ISSR827引物可檢測到8個等位變異點(diǎn)，多態(tài)性的條帶數(shù)為5，引物等位位點(diǎn)多態(tài)性為62.5 %，符合一般高等植物種間的多態(tài)性小于70 %的規(guī)律（周延清 等，2008）；從16份材料聚類結(jié)果可知（圖6），在歐氏距離7～10之間可分為4大類茄子，第1 類包括12、15、3、10、11、5、8、9、4、7、2、14、6，其余13、1、16分別為第2、3、4類。同一類群包括不同地方的品種，而同一地方的不同品種并沒有首先聚在一起，而且參試品種間的遺傳距離多數(shù)表現(xiàn)在5以下，說明廣西茄子栽培種來源地盡管很多，但它們多為相近品種，其遺傳基礎(chǔ)相對較狹窄，也反映了我國各地區(qū)之間茄子種質(zhì)資源交流頻繁。

3 結(jié)論與討論

圖6 ISSR分子標(biāo)記聚類圖

綜合上述單因素和正交試驗(yàn)，在茄子ISSR反應(yīng)體系中，Mg2+、dNTP兩者的濃度以2.0～3.0 mmol·L-1和0.32～0.36 mmol·L-1為宜，過低或過高都不利于ISSR擴(kuò)增，這與桂騰琴等（2009）、張文標(biāo)等（2006）研究結(jié)果一致。主要原因?yàn)镸g2+是TaqDNA聚合酶的激活劑，其濃度不僅影響酶的活性及合成的可靠性，而且還影響引物與模板的結(jié)合效率，Mg2+濃度過低會使Taq酶的作用效率低，擴(kuò)增效率下降，甚至不能擴(kuò)增出譜帶；Mg2+濃度過高，容易生成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，使背景加強(qiáng)。同理，dNTP濃度過低，分子中的磷酸基團(tuán)能定量地與Mg2+結(jié)合，使實(shí)際反應(yīng)中Mg2+濃度下降而影響聚合酶的活力，從而降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量；dNTP濃度過高則加快反應(yīng)速度，增加堿基的錯誤摻入率，從而會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，且dNTP也能與Mg2+結(jié)合，濃度過高對Mg2+產(chǎn)生抑制作用，使游離的Mg2+濃度降低（林萍 等，2005；佟漢文 等，2005；王瑜和袁慶華，2007；李嶸和王喆之，2008；黃宇 等，2009）。

Taq DNA聚合酶、引物濃度對PCR擴(kuò)增影響也很大。袁德義等（2008）、劉婷等（2009）認(rèn)為TaqDNA聚合酶、引物適宜濃度一般為0.5～5.0 U和0.1～0.5 μmol·L-1，本試驗(yàn)正交設(shè)計所得最佳處理的濃度也處于該范圍內(nèi)，且分別與毛偉海等（2006）、張濤等（2009）研究我國茄子種質(zhì)資源的ISSR標(biāo)記分析所選濃度基本一致。相反，濃度過低或過高有可能產(chǎn)生擴(kuò)增失敗。因?yàn)槊笣舛冗^高，不僅增加實(shí)驗(yàn)成本，而且易引起非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致背景彌散；酶濃度過低，則無擴(kuò)增產(chǎn)物或產(chǎn)物不穩(wěn)定（李嶸和王喆之，2008）；引物濃度過低時，不能進(jìn)行有效的擴(kuò)增，從而造成擴(kuò)增產(chǎn)物少；而引物濃度過高時，易引起堿基錯配和產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，還易形成引物二聚體，產(chǎn)生彌散背景（佟漢文 等，2005；李嶸和王喆之，2008；劉婷 等，2009）。

同時，本試驗(yàn)獲得優(yōu)化 ISSR反應(yīng)體系方案，經(jīng)驗(yàn)證基本達(dá)到條帶穩(wěn)定可靠、清晰豐富的要求，其為茄子品種鑒定、親緣關(guān)系分析和優(yōu)良新品種選育等研究提供科學(xué)依據(jù)。

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Optimization and Verification of ISSR Reaction System of Eggplant

LIANG Ren-fan1,2, WANG Yi-kui1, LI Wen-jia1, LI Yan1, WU Yong-guan1
（1Institute of Vegetable, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning530007, Guangxi, China; 2College of Agronomy，Guangxi University, Nanning530004 , Guangxi, China）

In this study, eggplant（Solanum melongena L.）was the test material. The total DNA was extracted from its fresh young leaves by modified CTAB method. The advantage of orthogonal design and single factor design were applied to optimize ISSR-PCR amplification system of eggplant in4 factors,such as Mg2+, dNTP, primer and Taq DNA polymerase at3 levels, and the optimal treatment was verified by16 cultivate eggplants fromguangxi. The results indicated that an optimal reaction system（25 μL）was established. It was consisted of2.5 μL10×buffer,2.0-3.0 mmol·L-1Mg2+,0.32-0.36 mmol·L-1dNTPs,0.4 μmol·L-1primer,50 ng template DNA,0.6 U Taq DNA polymerase. The sore band of the optimized treatment showed stabilization, distinct and abundant.

Eggplant; Optimization; ISSR; Verification

S641.5

A

1000-6346（2010）24-0048-05

2010-07-01；接受日期:2010-09-25

桂科能（0815011-6-1-16），院科技發(fā)展基金（2007009）

梁任繁，男，博士研究生，專業(yè)方向:作物栽培與分子生物學(xué)，E-mail:gxnkylrf@163.com