高 珊，江連洲，*，宋宏哲，婁 巍，范佳璐

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;2.黑龍江省雙河松嫩大豆生物工程有限責(zé)任公司，黑龍江哈爾濱150008)

利用球磨機(jī)提高大豆?jié)饪s蛋白乳化性的研究

高 珊1，江連洲1，*，宋宏哲2，婁 巍1，范佳璐1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;2.黑龍江省雙河松嫩大豆生物工程有限責(zé)任公司，黑龍江哈爾濱150008)

采用球磨機(jī)對(duì)大豆?jié)饪s蛋白進(jìn)行改性，經(jīng)球磨機(jī)處理的大豆?jié)饪s蛋白乳化性明顯提高。球磨機(jī)改性蛋白的最佳條件為轉(zhuǎn)速80r/min，球磨時(shí)間1h，大豆?jié)饪s蛋白填充量10g，大豆?jié)饪s蛋白含濕量85%，pH11。改性后濃縮蛋白的EAI為114.893m2/g，提高了120%。SDS－PAGE電泳圖譜對(duì)比分析了改性前后大豆?jié)饪s蛋白的結(jié)構(gòu)變化，研究表明，醇法大豆?jié)饪s蛋白經(jīng)過(guò)球磨機(jī)適當(dāng)處理后蛋白質(zhì)各組分含量發(fā)生了改變，蛋白乳化性能有明顯提高，拓寬了其在食品行業(yè)應(yīng)用的領(lǐng)域。

球磨機(jī)，大豆?jié)饪s蛋白，乳化性，改性

Abstract:The soybean protein concentration(SPC)was modified by ball milling in this experiment，the emulsibility was enhanced significantly after treatment.The optimum condition for ball milling were:rotational speed 80r/min，milling time 1h，fill content of SPC 10g，water content of SPC 85%，pH11.The EAI of SPC was determined after the ball milling which was 114.893m2/g，increased by 120%.The analysis on the change of SPC structure and conformation was studied with SDS－PAGE electrophoresis which showed that the various components content of the soybean protein was changed after ball milling.The protein emulsification was markedly improved，and the application area in the food industry was widened.

Key words:ball milling;soybean concentration protein;emulsibility;modification

大豆?jié)饪s蛋白是從脫脂大豆片或脫脂大豆粉中除去低分子可溶性非蛋白成分制得的大豆蛋白制品，其主要成分是蛋白和細(xì)胞壁多糖，蛋白質(zhì)含量干基在65%以上［1］。2000年全世界大豆?jié)饪s蛋白的總產(chǎn)量約為33萬(wàn)t，其中約31萬(wàn)t為醇法大豆?jié)饪s蛋白［2］。醇法大豆?jié)饪s蛋白的蛋白質(zhì)含量很高，但由于在加工過(guò)程中受到乙醇的作用，蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，大量的疏水基暴露，氮溶解指數(shù)(NSI)降低，某些功能性質(zhì)(如乳化性)減弱，影響了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用［3］。目前，針對(duì)蛋白改性有很多方法，其中包括物理改性、化學(xué)改性、酶改性和基因改性等等。物理改性由于具有費(fèi)用低、無(wú)毒副作用以及對(duì)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)性能影響較小等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用［4］。球磨機(jī)是粉碎研磨的一種常用設(shè)備，工作原理是當(dāng)電機(jī)通過(guò)齒輪帶動(dòng)筒體旋轉(zhuǎn)時(shí)，磨介在摩擦力、壓力和旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力共同作用下研磨物料。物料在機(jī)械球磨處理后，其分散性、化學(xué)活性也相應(yīng)升高［5］。原因在于球磨過(guò)程中，當(dāng)物質(zhì)受到?jīng)_擊、剪切、壓縮、拉伸或摩擦等機(jī)械力作用時(shí)，所施加的機(jī)械能一部分以各種形式儲(chǔ)于物質(zhì)內(nèi)部，由此引起物質(zhì)發(fā)生結(jié)構(gòu)及物理化學(xué)性質(zhì)變化(即機(jī)械力化學(xué)效應(yīng))［6］。本研究利用球磨機(jī)上述作用特性，對(duì)醇法大豆?jié)饪s蛋白進(jìn)行改性研究，尋求一種新的物理改性方法，簡(jiǎn)化傳統(tǒng)的改性工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醇法大豆?jié)饪s蛋白 黑龍江雙河松嫩大豆生物工程有限責(zé)任公司;氨水 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;三羥甲基胺基甲烷(Tris)、丙烯酰胺(Acr)、N，N'－甲叉雙丙烯酰胺(Bis)Sigma公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)Amresco公司;D532A標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白 寶生物工程(大連)有限公司;考馬斯亮藍(lán)R250、β－巰基乙醇、甘氨酸 北京索萊寶科技有限公司;丙三醇 分析純，上海試劑三廠;甲醇 分析純，天津市巴斯夫化工有限公司;冰乙酸 分析純，天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠;大豆色拉油市售。

球磨機(jī) 南京南大天尊電子有限公司;pH儀上海偉業(yè)儀器廠;真空干燥箱 大連第四儀表廠;高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;AM－77s均質(zhì)機(jī) NIHOHSEIKI KAISHA LID ACE HOMOGENIZER;KQ－100超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司;UV－2550紫外分光光度計(jì) 日本島津有限公司;電泳儀 POWERPAC BASIC POWER SUPPLY、電泳槽 Mini－PROTEAN Tetra Electrophoresis System BIO－RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 球磨機(jī)處理方法 大豆?jié)饪s蛋白與氨水在筒體內(nèi)混合，放入16個(gè)直徑為1cm的鋼球，將筒體對(duì)稱地放入球磨機(jī)，固定筒體后設(shè)置參數(shù)，進(jìn)行處理。

1.2.2 乳化性的測(cè)定［7］配制0.2%的大豆?jié)饪s蛋白分散液(pH8.05，0.05mol/L 的 Tris－HCl緩沖液)，取1mL花生油與3mL大豆?jié)饪s蛋白分散液于高速分散機(jī)均質(zhì)1min，立即從乳化液底部取0.1mL，用0.1%的SDS溶液稀釋到50mL，測(cè)定500nm處的A0，每個(gè)樣品重復(fù)三次，取平均值。

EAI(m2/g)=2×2.303×A0×稀釋倍數(shù)/(cφ×10000)

式中:A0為0min時(shí)吸光值;c為蛋白分散液濃度，g/mL;φ為油相體積分?jǐn)?shù)。

1.2.3 凝膠電泳［8－9］參照 Kong(2006)和郭堯君(1999)的SDS不連續(xù)電泳方法。使用12%的分離膠、5%的濃縮膠，樣品液最終蛋白濃度為3mg/mL，于－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與討論

2.1 球磨處理的單因素分析

2.1.1 轉(zhuǎn)速的影響 本實(shí)驗(yàn)球磨機(jī)處理?xiàng)l件為:時(shí)間2h，SPC填充量9g，含濕量70%，pH為9。研究了轉(zhuǎn)速分別為50、70、90、110、130、150r/min 時(shí)，對(duì)大豆?jié)饪s蛋白乳化性的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同球磨轉(zhuǎn)速對(duì)SPC乳化性的影響

從圖1可以看出，當(dāng)球磨機(jī)轉(zhuǎn)速在70r/min時(shí)SPC的乳化性明顯提高，而轉(zhuǎn)速在90～150r/min時(shí)乳化性變化不明顯。原因是當(dāng)球磨機(jī)轉(zhuǎn)速過(guò)大時(shí)，鋼球隨球磨機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)所產(chǎn)生的離心力與其重力相等，磨介在筒體內(nèi)壁做圓周運(yùn)動(dòng)［10］。此時(shí)鋼球與SPC沒(méi)有充分接觸摩擦，只對(duì)處在上層的SPC有摩擦作用。而當(dāng)轉(zhuǎn)速在50r/min時(shí)，轉(zhuǎn)速又太低，鋼球與SPC摩擦不激烈，產(chǎn)生改變SPC分子結(jié)構(gòu)的能量較小。

2.1.2 時(shí)間的影響 本實(shí)驗(yàn)球磨機(jī)處理?xiàng)l件為:轉(zhuǎn)速70r/min，SPC填充量9g，含濕量 70%，pH 為 9。實(shí)驗(yàn)分別選擇了球磨時(shí)間為1、2、3、4、5h對(duì)大豆?jié)饪s蛋白的乳化性影響進(jìn)行研究，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)SPC乳化性的影響

從圖2可以看出，當(dāng)球磨處理1h時(shí)SPC的乳化性提高最大，隨著球磨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SPC的乳化性逐漸降低。原因可能是球磨處理1h時(shí)，所產(chǎn)生新的SPC分子結(jié)構(gòu)中，親水基和親油基的比例最佳，乳化性能最高，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，球磨的摩擦作用破壞了SPC這些結(jié)構(gòu)，使乳化性降低。

2.1.3 SPC填充量的影響 球磨機(jī)處理?xiàng)l件:轉(zhuǎn)速70r/min，時(shí)間1h，含濕量70%，pH為9。SPC填充量對(duì)大豆?jié)饪s蛋白的乳化性影響如圖3。

圖3 不同磨介鋼球與SPC比例對(duì)SPC乳化性的影響

磨介鋼球與SPC作用程度的大小取決于鋼球在筒體內(nèi)部的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，一般情況下，鋼球呈泄落狀態(tài)運(yùn)動(dòng)對(duì)SPC的作用最大。而鋼球的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)與球磨機(jī)的直徑、轉(zhuǎn)速、磨介總質(zhì)量、SPC填充量等多因素有關(guān)，從圖3可以看出，當(dāng)SPC填充量為9g時(shí)，SPC的乳化性最大。

2.1.4 SPC含濕量的影響 球磨機(jī)處理?xiàng)l件為:轉(zhuǎn)速70r/min，時(shí)間1h，SPC填充量9g，pH為9。水作為化學(xué)反應(yīng)的常用介質(zhì)，由于與物料分子之間存在氫鍵、范德華力等，可促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，但考慮到水的量過(guò)大會(huì)影響磨介對(duì)物料的作用效果，也不利于后序干燥，所以控制含濕量在一定范圍內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)蛋白含濕量選擇60%～100%。蛋白含濕量對(duì)大豆?jié)饪s蛋白的乳化性影響如圖4。

從圖4可以看出，隨著含濕量的增加，球磨處理后的SPC乳化性呈先增加后減小的趨勢(shì)。球磨機(jī)是依靠磨介對(duì)物料的沖擊和摩擦所產(chǎn)生的擠壓力與剪切力來(lái)作用物料的［11］。當(dāng)含濕量過(guò)低時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒聚集在一起，不易與鋼球充分接觸摩擦，所以產(chǎn)生的機(jī)械力化學(xué)效應(yīng)小;含濕量過(guò)大，蛋白質(zhì)顆粒的韌性增強(qiáng)，不利磨介與蛋白的摩擦;本實(shí)驗(yàn)研究中含濕量達(dá)到90%時(shí)，SPC的乳化性最大。

圖4 不同SPC含濕量對(duì)SPC乳化性的影響

2.1.5 pH的影響 由于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)偏酸性，單純向蛋白質(zhì)中加水不利于SPC的溶解，本實(shí)驗(yàn)選擇以氨水調(diào)節(jié)SPC的pH在8～12之間，使SPC遠(yuǎn)離其等電點(diǎn)。一方面氨水為非極性分子，它可以與SPC中殘余的羧基、羥基等結(jié)合，使SPC的分子結(jié)構(gòu)重組;另一方面，氨水具有揮發(fā)性，可在后續(xù)干燥處理時(shí)除去，不產(chǎn)生鹽類物質(zhì)［12］。球磨處理?xiàng)l件:轉(zhuǎn)速70r/min，時(shí)間1h，SPC 填充量9g，含濕量90%，pH 選擇8～12。pH對(duì)大豆?jié)饪s蛋白的乳化性影響如圖5。

圖5 不同pH對(duì)SPC乳化性的影響

從圖5可以看出，隨著pH從8提高到11，SPC的乳化性隨之逐漸增大，當(dāng)pH達(dá)到11時(shí)SPC的乳化性提高最明顯。當(dāng)pH為12時(shí)，SPC的乳化性又降低，可能由于氨的數(shù)量過(guò)多時(shí)，阻礙了SPC分子之間的鍵合所致。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)確定球磨處理的最佳工藝條件

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以SPC的乳化性為測(cè)定指標(biāo)，對(duì)影響乳化性的主要因素選取五因素進(jìn)行L18(35)正交實(shí)驗(yàn)，以確定球磨機(jī)處理大豆?jié)饪s蛋白的最佳工藝條件。其正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，表2所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

由表2可知，5個(gè)因素中對(duì)改性結(jié)果的影響程度為E＞A＞C＞D＞B，說(shuō)明pH對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響最大，其次是轉(zhuǎn)速、時(shí)間、含濕量、蛋白填充量。最佳工藝條件是A3B3C2D1E3，最佳參數(shù)組不在正交表中，因此補(bǔ)充了一組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到改性蛋白的EAI為114.893m2/g。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 凝膠電泳

如圖6所示，泳道1為醇法大豆?jié)饪s蛋白的電泳圖譜，泳道2為經(jīng)過(guò)球磨處理后的醇法大豆?jié)饪s蛋白的電泳圖譜。通過(guò)泳道的顏色可以看出，經(jīng)過(guò)球磨處理的大豆?jié)饪s蛋白溶解性有所提高。球磨處理前后的SPC電泳圖譜通過(guò)GIS圖像分析軟件分析，分離出10種蛋白組分。如圖7所示，經(jīng)過(guò)球磨機(jī)處理的大豆?jié)饪s蛋白各蛋白組分發(fā)生了變化。

圖6 球磨處理前后SPC的電泳圖譜

圖7 球磨處理前后各蛋白組分的百分含量

3 結(jié)論

利用球磨機(jī)對(duì)醇法大豆?jié)饪s蛋白改性，簡(jiǎn)化了改性的工藝路線，突破了傳統(tǒng)改性工藝中水用量大、高壓高溫的特點(diǎn)，降低了對(duì)設(shè)備的要求和能源消耗，是醇法大豆?jié)饪s蛋白改性技術(shù)的一次飛躍。該方法改性的大豆?jié)饪s蛋白可以顯著提高大豆?jié)饪s蛋白的乳化性，最佳工藝條件為球磨機(jī)的轉(zhuǎn)速80r/min，SPC填充量 10g，球磨機(jī)處理時(shí)間 1h，SPC的含濕量85%，pH11，所得改性大豆?jié)饪s蛋白的 EAI為114.893m2/g，同比提高了120%。

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Study on enhancing the emulsibility of soybean protein concentration by ball milling

GAO Shan1，JIANG Lian－zhou1，*，SONG Hong－zhe2，LOU Wei1，F(xiàn)AN Jia－lu1
(1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China;2.Heilongjiang Shuanghe Songnen Soybean Bio－engineering Co.，Ltd.，Harbin 150008，China)

TS201.2+1

A

1002－0306(2010)08－0102－04

2009－09－15 *通訊聯(lián)系人

高珊(1984－)，女，碩士研究生，研究方向:農(nóng)產(chǎn)品深加工。

農(nóng)業(yè)部大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目(nycytx－004)。