暢曉潔，范俊峰，鄭必勝，*

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640;2.北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，北京100083)

黑燕麥醋對血小板聚集功能的影響

暢曉潔1，范俊峰2，鄭必勝1，*

(1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640;2.北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，北京100083)

以黑燕麥醋中的不同極性組分為研究對象，評價其對由二磷酸腺苷(ADP)和凝血酶誘導的血小板聚集反應的影響。采用比濁法，記錄了黑燕麥醋中的不同極性組分在20min內(nèi)對由不同誘導劑誘導的血小板聚集反應的光密度(OD)值的變化情況，分析了其中不同極性組分1、5min的聚集率、最大聚集率及聚集抑制率。與空白對照組相比，各種極性組分均對由ADP和凝血酶誘導的血小板聚集有抑制作用，且抑制作用均呈濃度依賴型。

黑燕麥醋，ADP，凝血酶，聚集抑制率

Abstract:The effects of the different polar components of black oats vinegar，on the reaction of platelet aggregation induced by adenosine diphosphate(ADP)and thrombin were assessed.Using turbidimetry，the changes of OD value of the response of platelet aggregation induced by ADP and thrombin in 20 minutes were recorded，too.The 1，5min aggregation rate and maximum aggregation rate and aggregation inhibition rate of the different polar components were analyzed.Compared with the controlled group，all the components with different polarities concentration-independently inhibited the platelet aggregation induced by ADP and thrombin.

Key words:black oats vinegar;ADP;thrombin;aggregation inhibition rate

血栓栓塞性疾病是當前危害人類健康，導致死亡率最高的原因之一［1］。血小板作為血栓的主要組成部分，在血栓形成過程中發(fā)揮了重要的作用，血小板聚集性是預示血栓形成趨勢的重要參數(shù)［2］。近年來，出現(xiàn)了許多有關(guān)降低血小板聚集性的單味藥、中藥有效成分及中成藥、復方藥方面的研究，如陳鐸葆［3］實驗表明紅花水提物對心肌缺血模型大鼠有較強的抑制血小板聚集作用，任建勛等［4］觀察發(fā)現(xiàn)牛黃降壓丸可以抑制ADP誘導的血小板聚集等等。雖然研究均取得了一定的進展，但仍存在一些不足，而且大多數(shù)學者的研究都集中在活血化瘀的藥物上，對其他藥物或食源性物質(zhì)的研究甚少［5］。醋在我國的飲食文化中有重要的地位，它不僅是傳統(tǒng)的酸味劑，而且自古以來就藥食同源。對醋的現(xiàn)代研究，始于日本黑醋，重點研究了其在清除自由基活性及降血壓等方面的功能性［6］。我國有很多歷史名醋，研究其功能性的只有鎮(zhèn)江香醋［7］一種。研究認為這些醋可清除自由基，降血壓，防癌，預防骨質(zhì)疏松，抑菌，殺菌并對心肌梗塞、動脈硬化、高血壓等疾病有著良好的療效［8-9］。最新研究表明，醋能改善血液的流變性，具有很好的生物調(diào)節(jié)功能［6］。本文研究了黑燕麥醋對由ADP和凝血酶這兩種關(guān)鍵誘導劑所引起的血小板聚集性的影響，并對其作用機理進行討論，為食醋作為預防血栓栓塞性疾病的食源性物質(zhì)提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑燕麥醋 山西紫苑生物科技開發(fā)公司;健康豬血 北京第五肉聯(lián)廠;牛血清白蛋白、肝素鈉、HEPES(貨號:H3375)Sigma公司，Biotech Grade;ADP Amresco公司，Ultra Pure Grade;葡萄糖、檸檬酸三鈉 分析純，北京化工廠。

GL-20G-Ⅱ冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;FD-1型真空冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;Model 680酶標儀 Bio-RAD伯樂公司;R2002B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑燕麥醋中不同極性成分的分離［7］將黑燕麥醋通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后用乙酸乙酯連續(xù)萃取，將乙酸乙酯萃取物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑，真空干燥得組分1。乙酸乙酯萃余物用3倍體積乙醇沉淀，將乙醇沉淀用水溶醇沉。合并上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，上清液濃縮物依次用無水丙酮、無水乙醇溶解，分別將丙酮溶解物、乙醇溶解物真空濃縮、真空干燥得到組分2和組分3，將乙醇不溶物真空干燥得到組分4。沉淀物用水溶解，真空濃縮、真空干燥，得到組分5。

1.2.2 ADP誘導的血小板聚集率的測定

1.2.2.1 富含血小板血漿(PRP)的制備 將健康豬血與3.8%檸檬酸三鈉以體積比為9∶1混勻，并收集于離心管中，于室溫(20～25℃)下以250×g轉(zhuǎn)速離心 10min，取出上層清液，既得到 PRP［10］。

1.2.2.2 聚集率的測定 在酶標板中依次加入新鮮PRP 200μL 和不同濃度(1、2、4 和10mg/mL)的分離得到的黑燕麥醋的各個極性組分20μL，37℃恒溫孵育5min。之后，依次再加入20μL的ADP溶液，使其終濃度為10μmol/L。迅速放于酶標儀中，在630nm波長下振蕩30s，混勻后測定，每隔30s記錄一次，記錄20min內(nèi)的OD值的變化，每個樣品重復5次，并計算其1、5min聚集率、最大聚集率以及聚集抑制率［11］。

實驗中，將醋樣品改加為等體積的磷酸緩沖液(PBS)作為空白對照，將醋樣品改加為等體積的肝素鈉溶液(終濃度為5μg/mL)作為陽性對照。并用200μL的PRP、20μL PBS和 20μL 的生理鹽水(NS)混合液作為背景吸收除去。

聚集率及聚集抑制率計算方法如下:

聚集率(%)=(OD初-OD末)/OD末×100%

聚集抑制率(%)=(空白對照組最大聚集率-醋樣組最大聚集率)/空白對照組最大聚集率× 100%［12］。

1.2.3 凝血酶誘導的血小板聚集率的測定

1.2.3.1 洗滌血小板血漿(WRP)的制備 將PRP于室溫(20～25℃)下以800×g轉(zhuǎn)速離心10min，上層澄清液即為貧血小板血漿(PPP)［13］。將離心后的下層沉淀物用 pH6.35的 Tyrode-HEPES緩沖液［14］(NaCl 138.3mmol/L，KCl 2.68mmol/L，MgCl2·6H2O 1.0mmol/L，NaHCO34.0mmol/L，HEPES 10mmol/L，葡萄糖 0.1%(w/v)，牛血清白蛋白0.35%(w/v))洗滌兩次，并將其最終懸浮在pH為7.35的Tyrode-HEPES緩沖液，即為WRP。使用時用PPP將其OD值調(diào)為0.15［15］。

1.2.3.2 聚集率的測定 在酶標板中依次加入5μL CaCl2(Ca2+終濃度為 1mmol/l)、不同濃度(1、2、4和10mg/mL)的分離得到的黑燕麥醋的各個極性組分20μL、凝血酶(0.1U/mL)20μL，37℃恒溫孵育 5min。加入已調(diào)節(jié)OD值的WRP懸浮液200μL，迅速放于酶標儀中在630nm波長下振蕩30s后記錄，每隔30s記錄一次，記錄20min內(nèi)的OD值的變化，每個樣品做5個平行，并計算其1、5min聚集率、最大聚集率及聚集抑制率［16-17］。

將醋樣改加為等體積的NS作為空白對照，將醋樣改加為肝素鈉溶液(終濃度為5μg/mL)作為陽性對照。并用200μL的PRP、45μL的NS混合液作為背景吸收除去。

聚集率及聚集抑制率計算方法如下:

聚集率(%)=(OD初-OD末)/OD末×100%

聚集抑制率(%)=(空白對照組最大聚集率-醋樣組最大聚集率)/空白對照組最大聚集率× 100%［12］

2 結(jié)果與分析

2.1 ADP誘導的血小板聚集率的測定結(jié)果

由表1的實驗結(jié)果可知，黑燕麥醋中的不同極性組分對由ADP誘導的血小板聚集均有抑制作用，且同一極性組分的抑制作用強弱與其濃度呈劑量依賴型。與空白對照組相比，第2，3，4組分的1、5min聚集率和最大聚集率均有明顯降低，但其聚集抑制率明顯低于肝素鈉(5μg/mL)。第5組分在1min時，其血小板聚集率明顯小于肝素鈉(5μg/mL)的聚集率，且其聚集抑制率亦高于肝素鈉(5μg/mL)，即該組分在作用時間及作用強度方面均優(yōu)于肝素鈉(5μg/mL)。第1組分在1、5min時，血小板聚集率低于肝素鈉，但其聚集抑制率接近于肝素鈉(5μg/mL)。經(jīng)比較可知，黑燕麥醋中含具有抑制血小板聚集的功能性成分，且其作用最強的成分可能存在于第5組分。但整體評價而言，其作用速度較緩，作用強度稍低于肝素鈉(5μg/mL)。具體影響見表1。

2.2 凝血酶誘導的血小板聚集率的測定結(jié)果

黑燕麥醋中的不同極性組分對由凝血酶誘導的血小板聚集均有抑制作用，且同一極性組分的抑制作用強弱與其濃度呈劑量依賴型。其中的5種不同極性組分中，除第1組分外，5min時，其他所有組分在低濃度時，血小板聚集率明顯優(yōu)于肝素鈉(5μg/mL);只有第3和4組分，1min時，在低濃度下，亦表現(xiàn)出其優(yōu)于肝素鈉的血小板聚集率，說明這兩組分中的功能性成分在較短的反應時間內(nèi)就能發(fā)揮抑制作用且起作用的時間較長，其他組分中的功能性成分發(fā)揮作用則較慢。在所有組分中，只有第5組分在高濃度時，其聚集抑制率高于肝素鈉(5μg/mL)，其他組分均明顯低于肝素鈉(5μg/mL)，其中第2組分的聚集抑制率最低，但與空白對照相比，其聚集抑制作用仍很明顯。具體影響見表2。

3 討論

血小板功能亢進是造成心腦血管疾病過程中的重要病理表現(xiàn)，與心腦血管事件發(fā)生有直接的關(guān)系。抑制血小板功能明顯降低心腦血管事件的發(fā)生已被很多臨床研究證實［18］。ADP誘導的血小板聚集是通過一個與G蛋白偶聯(lián)的P2嘌呤型受體，使GPⅡb/Ⅲa分子活化，以便與纖維蛋白原結(jié)合，從而導致血小板聚集。血小板ADP受體轉(zhuǎn)導激活信號的過程尚不清楚，但有證據(jù)表明其通過抑制腺苷酸環(huán)化酶活性及增加胞漿鈣離子濃度參與血小板的聚集反應［19］。凝血酶則是通過膜受體激活血小板，當這一血小板強激動劑刺激血小板時，細胞外鈣流入胞漿是凝血酶升高血小板內(nèi)鈣離子的主要途徑，同時細胞內(nèi)鈣池也釋放鈣到胞漿，胞漿游離鈣水平升高［20］，而鈣離子作為活化信息的傳遞者，通過活化細胞內(nèi)磷脂酶C(PLC)和磷脂酶A2(PLA2)作用于磷脂，產(chǎn)生血栓素A2(TXA2)或血小板活化因子(PAF)等血小板活化的重要介質(zhì)，使血小板變形、分泌、釋放以及外膜表面改變，并發(fā)生聚集反應，導致血小板聚集［21］。

表1 黑燕麥醋的各個組分對由ADP誘導的血小板聚集率的影響

表2 黑燕麥醋的各個組分對由凝血酶誘導的血小板聚集率的影響

本實驗結(jié)果表明，黑燕麥醋中的不同極性組分對由ADP和凝血酶誘導的血小板聚集反應均有抑制作用，且其中的第5組分從反應時間及作用強度方面均優(yōu)于其他組分，甚至與肝素鈉作用相當。但由于本實驗中所采用的肝素鈉濃度僅為5μg/mL，遠遠低于樣品濃度，由實驗結(jié)果可推測，當樣品與肝素鈉同等劑量時，其抑制血小板聚集率將會稍遜于肝素鈉，而不一定能作為藥物進行臨床應用，但其可作為預防栓塞性疾病的理想食療對象。同時，由誘導劑的誘導途徑可初步推測，黑燕麥醋之所以具有抑制血小板聚集的作用，可能是由于其中含有能夠抑制血小板表面GPⅡb/Ⅲa分子與鈣依賴性纖維蛋白原受體的結(jié)合或含有抑制ADP與血小板膜受體的結(jié)合的功能性成分，以及抑制凝血酶與膜受體結(jié)合或者阻礙細胞外鈣流入胞漿進而抑制胞漿中游離鈣水平升高的功能性成分即鈣拮抗劑。但黑燕麥醋中的功能性成分究竟為哪種具體物質(zhì)，仍有待進一步研究。

［1］郭丹.眼鏡蛇毒蛋白酶natrahagin的純化及抗血栓作用［D］.藥理學，1999.

［2］全吉淑，尹學哲.大豆胚軸中異黃酮的提取及其抗血小板聚集作用的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27(10):57-59.

［3］陳鐸葆.紅花水提物對心肌缺血大鼠的血液流變學與血小板聚集影響的實驗研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2004，11(5):290-291.

［4］任建勛，張雷，孫靜文，等.牛黃降壓丸對正常大鼠血小板功能的影響與作用機制的實驗研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2007，13(11):34-36.

［5］王婕，林成仁，王敏，等.中藥對血小板功能影響的研究進展［J］.北京中醫(yī)藥，2008，27(11)，893-896.

［6］Shoko Nishidai.Kurosu，a Traditional Vinegar Produced from Unpolished Rice，Suppresses Lipid Peroxidation in Vitro and in Mouse Skin［J］.Bio Sci Biotechnol Biochem，2000，64(9):1909-1914.

［7］徐清萍.鎮(zhèn)江香醋抗氧化性研究［D］.江南大學博士論文，2005.

［8］徐清萍，敖宗華.食醋功能研究進展(上)［J］.中國調(diào)味品，2003(12):11-13.

［9］徐清萍，敖宗華.食醋功能研究進展(下)［J］.中國調(diào)味品，2004(1):19-23.

［10］Jung-Jin Lee，Yong-Ri Jin，et al.Antiplatelet activity of carnosol is mediated by the inhibition of TXA2 receptor and cytosolic calcium mobilization［J］.Vascular Pharmacology，2006(45):148-153.

［11］Kyung-Ae Lee，Seung-Ho Kim.SSGE and DEE，new peptides isolated from a soy protein hydrolysate that inhibit platelet aggregation［J］.Food Chemistry，2005，90:389-393.

［12］Moo-Sung Kim，Kyung-Ae Lee.Antithrombotic activity of methanolic extract of Umbilicaria esculenta［J］.Journal of Ethnopharmacology，2006，105:342-345.

［13］Endre Pongrácz.Measurementofplateletaggregation duringantiplatelet therapy in ischemic stroke［J］.Clinical Hemorheology and Microcirculation，2004，30:237-242.

［14］Yong-Ri Jin，Xiang-Hua Han，et al.Antiplatelet activity of hesperetin，a bioflavonoid，is mainly mediated by inhibition of PLC- γ2 phoshorylation and cyclooxygenase-1 activity［J］.Atherosclerosis，2006，10.

［15］Horn，F(xiàn) dos Santos，P Termignoni.Boophilus microplus anticoagulant protein:an antithrombin inhibitor isolated from the cattle tick saliva［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2000，384:68-73.

［16］Emil V，Negrescu，Bernd Grunberg，et al.Interaction of Antiplatelet Drugs In Vitro:Aspirin，Iloprost，and the Nitric Oxide Donors SIN-1 and Sodium Nitroprusside［J］.Cardiovascular Drugs and Therapy，1995，9:610-629.

［17］N Moran，A Kiernan，et al.Monitoring modulators of platelet aggregation in a microtiter plate assay［J］.Analytical Biochemistry，2006(357):77-84.

［18］管斯斯，齊若梅，姜秀新，等.硝普鈉對增齡機體血小板功能影響的研究［J］.中國藥理學報，2008，24(11):1475-1478.

［19］陳鵬，胡曉立，雷偉亞，等.三七葉甙對兔血小板聚集功能的影響［J］.云南大學學報，2005，27(1):82-85.

［20］陳鵬，楊麗川，雷偉亞，等.白藜蘆醇甙對血小板聚集功能及內(nèi)鈣水平的影響［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17(1):21-25.

［21］Nesbitt WS，Giuliano S，Kulkarni S，et al.Intercellular calcium communication regulates platelet aggregation and thrombus growth［J］.Cell Biol，2003，160(7):1151-1161.

Effect of black oats vinegars on platelet aggregation function

CHANG Xiao-jie1，F(xiàn)AN Jun-feng2，ZHENG Bi-sheng1，*
(1.College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China;2.College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing100083，China)

Q592.1

A

1002-0306(2010)08-0334-04

2009-12-22 *通訊聯(lián)系人

暢曉潔(1987-)，女，碩士生，研究方向:糖類分離提純新方法新技術(shù)。