高立偉 朱文 李潞 侯梅 馬力 趙穎 周清華

肺癌侵襲轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多階段、多因素和多基因控制的十分復(fù)雜的過程。闡明肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機理、尋找和開發(fā)控制或逆轉(zhuǎn)肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的新途徑、新技術(shù)、新方法和新藥物，是改善肺癌患者預(yù)后、提高生存質(zhì)量和生活質(zhì)量的最重要的措施。nm23基因是近年克隆并鑒定出的一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，該基因家族有8個成員，其中起主要作用的是nm23-H1基因[1-7]，本課題組從DNA、mRNA和蛋白水平就nm23-H1基因在肺癌中的表達水平變化、等位基因缺失與肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)性等進行了一系列的研究，將這種多基因參與共同抑制腫瘤轉(zhuǎn)移表型的作用稱為“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級聯(lián)”，提出nm23-H1基因可能是“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級聯(lián)”中的一個關(guān)鍵基因[1,2]。但是目前有關(guān)該基因調(diào)控肺癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的確切機理尚未明了，特別是其發(fā)揮作用的具體生化途徑亦尚未明確，仍需更深入的研究。近年來蛋白質(zhì)組技術(shù)由于高通量、高靈敏度的特點應(yīng)用于腫瘤分子生物學(xué)研究。本研究采用比較蛋白質(zhì)組技術(shù)，研究人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株（L9981）與轉(zhuǎn)染nm23-H1基因L9981細胞株（L9981-nm23-H1）間的差異表達蛋白，為闡明nm23-H1基因調(diào)控“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級聯(lián)”的分子作用機制提供理論基礎(chǔ)，為篩選逆轉(zhuǎn)或控制肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子靶點及肺癌預(yù)后的分子診斷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 細胞株 L9981為四川大學(xué)華西醫(yī)院四川省肺癌分子重點實驗室應(yīng)用單個細胞克隆化技術(shù)從人大細胞肺癌細胞株WCQH-9801中篩選建立的nm23-H1基因缺失的人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株；L9981-nm23-H1為四川大學(xué)華西醫(yī)院四川省肺癌分子重點實驗室建立的轉(zhuǎn)染野生型nm23-H1基因的L9981細胞株。

1.1.2 主要試劑和儀器 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris-base、過硫酸銨、TEMED、二硫蘇糖醇（dithiothreitol, DTT）、尿素、瓊脂糖、溴酚藍、CHAPS、SDS、低分子量標準蛋白以及24 cm IPG干膠條（pH3-10, 24 cm）均為瑞典Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品；RNA酶（RNaseA）和碘乙酰胺為美國Sigma公司產(chǎn)品；甘氨酸及考馬斯亮藍為美國Amresco公司產(chǎn)品；所有溶液均用Milli-Q水配制。IPGphor水平電泳儀、垂直板電泳儀及圖像分析軟件ImageMasterTM2D Platinum Software（version 5.0）為瑞典Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品；Daltonics AutoFlex TOFTOF LIFT Mass Spectrometer質(zhì)譜儀購自德國Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與細胞總蛋白制備 細胞傳代培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，生長至對數(shù)生長期時，胰酶消化，漂洗后將每2×106個細胞重懸于100 μL預(yù)冷裂解緩沖液中，4oC靜置30 min；冰浴下超聲破碎細胞；4oC、20 000 rpm離心30 min，上清液即為所要的蛋白溶液；Bradford法[8]測定細胞總蛋白濃度，分裝后-80oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 固相pH梯度雙向凝膠電泳及凝膠圖像分析 按照IPGphorTM等電聚焦系統(tǒng)操作指南，1 000 μg總蛋白與水化液混合均勻，總體積450 μL，用18 cm pH3-10的IPG膠條進行第一向水平等電聚焦和第二向垂直板SDS-PAGE電泳，凝膠經(jīng)經(jīng)典考染[9]置于掃描儀上掃描，得到數(shù)字化的凝膠圖像文件。運用ImageMasterTM2D Platinum Software（version 5.0）圖像分析軟件進行分析，得到差異表達蛋白質(zhì)點。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 質(zhì)譜鑒定及數(shù)據(jù)庫查詢 從凝膠上切取差異表達蛋白質(zhì)點，脫色，膠內(nèi)酶切，采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF-MS）的方法，獲得肽質(zhì)量指紋譜，通過Mascot軟件查詢NCBInr數(shù)據(jù)庫，肽片斷序列匹配分數(shù)高于35分認為有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）[10,11]。

2 結(jié)果

對L9981與L9981-nm23-H1雙向凝膠電泳圖譜的蛋白點進行匹配、比較后發(fā)現(xiàn)：有5個蛋白點僅在L9981中出現(xiàn)，有9個蛋白點僅在L9981-nm23-H1中出現(xiàn)；在L9981與L9981-nm23-H1中均存在、但在L9981中的表達量顯著高于L9981-nm23-H1的蛋白點有16個，在L9981-nm23-H1的表達量顯著高于L9981的蛋白點有12個。L9981與L9981-nm23-H1間差異表達的蛋白點在凝膠上的分布見圖1、圖2。僅存在于L9981或L9981-nm23-H1中的蛋白點的放大圖見圖3。

圖 1 L9981與L9981-nm23-H1間差異表達的蛋白質(zhì)點Fig 1 Protein spots differentially expressed in L9981 compared with L9981-nm23-H1. Spot ID in bracket indicates the protein that was only detected in L9981； Spot ID no in bracket indicates the protein whose%vol in L9981 was more than two times higher than that in L9981-nm23-H1.

圖 2 L9981與L9981-nm23-H1間差異表達的蛋白質(zhì)點Fig 2 Protein spots differentially expressed in L9981-nm23-H1 compared with L9981. Spot ID in bracket indicates the protein that was only detected in L9981-nm23-H1； Spot ID no in bracket indicates the protein whose %vol in L9981-nm23-H1 was more than two times higher than that in L9981.

圖 3 L9981與L9981-nm23-H1間部分差異表達的蛋白質(zhì)點Fig 3 Zoomed-in images of some differentially-expressed protein spots in L9981 and L9981-nm23-H1

從L9981與L9981-nm23-H1間差異表達蛋白點中選取25個差異明顯的蛋白質(zhì)點切割下來，膠內(nèi)酶解，進行質(zhì)譜鑒定，查詢蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，獲得17個L9981和L9981-nm23-H1間差異表達蛋白質(zhì)的明確信息：nm23-H1基因轉(zhuǎn)染使人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株L9981原有蛋白-鹵酸脫鹵酶樣水解酶包含域2 （haloacid dehalogenase-like hydrolase domain containing 2）表達缺失；出現(xiàn)了三磷酸腺苷酶（ATPase）的表達；2-磷酸烯醇丙酮酸水合酶-α-烯醇酶（2-phosphopyruvate-hydratase alpha-enolase）、碳酸脫氫酶（carbonate dehydratase）、波形蛋白（vimentin）、甘氨酰tRNA合成酶（ glycyl tRNA synthetase, GARS）、β-actin突變體、肽基脯氨酸異構(gòu)酶D（peptidylprolyl isomerase D,PPIase D）、v-crk肉瘤病毒CT10癌基因類似同族體（v-crk sarcoma virus CT10 oncogene homolog-like）、尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶（UDP-glucose dehydrogenase）、溶菌酶（lysosomal）、26S蛋白酶體調(diào)節(jié)鏈4表達下調(diào)，核纖層蛋白A/C轉(zhuǎn)錄異體1（lamin A/C transcript variant 1）、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HG phosphoribosyl transferase,HGPRT）、核纖層蛋白A、遠端上游調(diào)控元件結(jié)合蛋白2、甲基丙烯酰-輔酶A-羧化酶2（methylcrotonoyl-coenzyme A carboxylase 2）表達上調(diào)。

3 討論

迄今，有關(guān)nm23-H1基因轉(zhuǎn)染前后人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株L9981中蛋白質(zhì)表達的變化，國內(nèi)外未見報道。本研究將人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株L9981和轉(zhuǎn)染nm23-H1基因的人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株L9981-nm23-H1三次實驗的凝膠圖像比較后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染nm23-H1基因后使L9981蛋白質(zhì)組的表達譜發(fā)生了明顯變化：nm23-H1基因轉(zhuǎn)染使人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株L9981原有蛋白-鹵酸脫鹵酶樣水解酶包含域2表達缺失；出現(xiàn)了三磷酸腺苷酶的表達；2-磷酸烯醇丙酮酸水合酶-α-烯醇酶、碳酸脫氫酶、波形蛋白、甘氨酰tRNA合成酶、β-actin突變體、肽基脯氨酸異構(gòu)酶D、v-crk肉瘤病毒CT10癌基因類似同族體、26S蛋白酶體調(diào)節(jié)鏈4表達下調(diào)，核纖層蛋白A/C轉(zhuǎn)錄異體1、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、核纖層蛋白A、遠端上游調(diào)控元件結(jié)合蛋白2、甲基丙烯酰-輔酶A-羧化酶2表達上調(diào)。這些蛋白質(zhì)大致可以歸納為5類：①細胞骨架相關(guān)蛋白：波形蛋白、核纖層蛋白A/C轉(zhuǎn)錄異體1；②信號傳導(dǎo)蛋白：v-crk肉瘤病毒CT10癌基因類似同族體；③細胞代謝相關(guān)蛋白：鹵酸脫鹵酶樣水解酶包含域2、2-磷酸烯醇丙酮酸水合酶-α-烯醇酶、碳酸脫氫酶、甘氨酰tRNA合成酶、肽基脯氨酸異構(gòu)酶D、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、甲基丙烯酰-輔酶A-羧化酶2、蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶II，β-同工酶1屬于蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（methionine adenosyltransferase, MAT）家族；④發(fā)育、增殖相關(guān)蛋白：三磷酸腺苷酶、26S蛋白酶體（proteasome）調(diào)整鏈4、遠端上游調(diào)控元件結(jié)合蛋白2（FUSE binding protein 2, FUSE-BP 2）；⑤腫瘤生長侵襲相關(guān)蛋白：尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶、溶菌酶。

ATP和ADO可作為P受體的激動劑刺激多種細胞的生長。Batra等[12]曾報道，低濃度ATP刺激SKOV-3腫瘤細胞增殖，高濃度ATP（100 μmol/L-1 mmol/L） 則明顯抑制SKOV-3的增殖。相反，Tey等[13]卻發(fā)現(xiàn)，低濃度（10 μmol/L）ADO具有明顯抑制A431腫瘤細胞增殖的作用，而高濃度的ADO（100 μmol/L）可促進其增殖。在本實驗中我們觀察到L9981-nm23-H1中出現(xiàn)了ATPase的表達，ATPase的主要功能為水解ATP，使L9981-nm23-H1肺癌細胞株內(nèi)ATP濃度降低，我們的研究結(jié)果與Tey等的研究結(jié)果比較一致。推測低濃度ATP可能與抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，ATPase可能是參與“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級聯(lián)”的一種蛋白。

腫瘤細胞代謝以高比率的需氧糖酵解為其特征。這種高代謝需要相關(guān)的糖酵解酶的活性及其同工酶類型的相應(yīng)改變以適應(yīng)腫瘤的生物活性。催化糖原酵解途徑中甘油分解的最后的酶—神經(jīng)特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase, NSE）研究較多，目前認為它不僅是所有類型神經(jīng)細胞的標記物，而且是所有神經(jīng)內(nèi)分泌或神經(jīng)旁細胞和各種各樣的惡性瘤甚至非神經(jīng)內(nèi)分泌類型的標記物。有研究發(fā)現(xiàn)NSE在腎癌組織中的含量是正常腎皮質(zhì)的34倍。80%的腎癌（renal cell carcinoma, RCC）患者NSE水平增高，且與腫瘤分期、分級呈正相關(guān)，與腫瘤的治療隨訪、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性[14]。本研究觀察到轉(zhuǎn)染nm23-H1基因后，人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株L9981中2-磷酸烯醇丙酮酸水合酶-α-烯醇酶表達下調(diào)，提示2-磷酸烯醇丙酮酸水合酶-α-烯醇酶可能參與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程。

波形蛋白（vimentin）曾作為間葉組織起源腫瘤的特異性標記。但近年來，文獻[15]報道一些上皮性腫瘤也可以有波形蛋白表達。Catter等[16]報道肺鱗癌波形蛋白陽性率為30%，肺腺癌為23.5%。波形蛋白的陽性表達與肺癌患者的預(yù)后有明顯聯(lián)系。本研究觀察到轉(zhuǎn)染nm23-H1基因后，人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株波形蛋白表達下調(diào)，提示該蛋白可能參與人大細胞肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程。

人酪氨酰-tRNA合成酶（tyrosyl tRNA synthetase,TyrRS） 在血管發(fā)育的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，可促進血管生成；而人色氨酰-tRNA合成酶的片段則具有抑制血管生長的功能。本研究觀察到轉(zhuǎn)染nm23-H1基因后，人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株L9981甘氨酰tRNA合成酶（glycyl tRNA synthetase, GARS）表達下調(diào)，由此推斷甘氨酰tRNA合成酶可能參與肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程。

核纖層蛋白A與C在細胞分化達到較高程度、顯示一定表型的時候才出現(xiàn)。Broers等[17]對人肺癌細胞株進行研究，發(fā)現(xiàn)核纖層蛋白B在小細胞肺癌細胞株和非小細胞肺癌細胞株中均有表達；核纖層蛋白A和C在非小細胞株中表達，而在小細胞肺癌細胞株中表達極為低下或缺乏。較高水平的核纖層蛋白A和C反映了分化的、非增殖細胞的核穩(wěn)定性。而低水平核纖層蛋白A和C是細胞核處于組織結(jié)構(gòu)程度較低的細胞特征，表示細胞處于增殖周期過程。本研究觀察到轉(zhuǎn)染nm23-H1基因后，人高轉(zhuǎn)移大細胞肺癌細胞株核纖層蛋白A/C（lamin A/C）轉(zhuǎn)錄異體1表達上調(diào)，提示該蛋白可能也是nm23-H1基因參與“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級聯(lián)”的一種蛋白。

本研究結(jié)果為揭示nm23-H1基因腫瘤轉(zhuǎn)移抑制的分子機制提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)，可能有助于為逆轉(zhuǎn)人大細胞肺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移提供新的治療靶點。當然，由于雙向凝膠電泳技術(shù)本身存在較多的局限性[18,19]。本研究結(jié)果尚需進一步的深入研究，以證實這些差異表達蛋白在肺癌侵襲轉(zhuǎn)移及“肺癌轉(zhuǎn)移抑制級聯(lián)”中的作用。