唐躍年，金，張 健，陸曉彤（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥劑科，上海市 200092）

RP-HPLC法測(cè)定射干合劑中黃酮類多指標(biāo)成分的含量Δ

唐躍年＊，金，張 健，陸曉彤（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥劑科，上海市 200092）

目的：建立以反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定射干合劑中黃芩苷等5種黃酮類化合物含量的方法。方法：樣品經(jīng)超聲提取后，用Inertsil?ODS-3色譜柱分離樣品，流動(dòng)相為乙腈-1‰磷酸（pH 2.25，梯度洗脫），流速為1 mL·min-1，柱溫為室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；外標(biāo)法定量。結(jié)果：黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、射干苷、次野鳶尾黃素的線性范圍均為0.05～50 μg·mL-1（r均≥0.998 9）；平均加樣回收率為96.52%～101.22%，RSD均≤4.4%（n＝9）。結(jié)論：本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于射干合劑中黃酮類化合物多指標(biāo)成分的含量測(cè)定，也可用于其制劑及體內(nèi)指標(biāo)成分的研究。

黃酮類化合物；反相高效液相色譜法；射干合劑；含量測(cè)定

射干合劑為本院自制制劑，具有宣肺清熱、止咳祛痰平喘的作用，用于治療感冒咳嗽、急性支氣管炎及哮喘性支氣管炎、多痰，有很高的臨床療效。中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制，目前常采用指紋圖譜[1～4]、多指標(biāo)含量測(cè)定[5]方法。研究發(fā)現(xiàn)[6～8]射干中黃酮類化合物具有廣泛的藥理活性，如抗炎、降壓、清除自由基、抗心律失常等作用，在臨床上應(yīng)用廣泛。為了提高本制劑的質(zhì)量，控制本制劑臨床療效的穩(wěn)定性，筆者對(duì)射干合劑中黃酮類化合物多指標(biāo)化學(xué)成分進(jìn)行了相關(guān)分析。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1100系列高效液相色譜（HPLC）儀（美國惠普公司）；Labofuge 400R型高速離心機(jī)（上海力新有限公司）；XW-80型旋渦混合器、XW-80A型液體快速混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；BX 50型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；pHS-3TC型精密數(shù)顯酸度計(jì)（上海天達(dá)儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；As3120B型超聲波清洗器（上海醫(yī)用分析儀器廠）。

1.2 試藥

黃芩苷（baicalin，BCL，批號(hào)：110715-200815）、黃芩素（baicalein，BCN，批號(hào)：111595-200604）、漢黃芩素（wogonin，WGN，批號(hào)：111514-200403）、射干苷（tectoridin，TRD，批號(hào)：110715-200815）、次野鳶尾黃素（irisflorenti，IRT，批號(hào)：110715-200815）對(duì)照品均購自中國藥品生物制品檢定所；射干合劑（上海美優(yōu)制藥廠加工，批號(hào)：070601、071201、081001）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Tedia公司）；水為雙蒸水，其余試劑均為分析純；全部溶劑均采用0.22 μm微孔濾膜過濾。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil?ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-1‰磷酸（pH 2.25），梯度洗脫（0→30→60→70 min：乙腈的體積百分?jǐn)?shù)為10%→30%→60%→10%）；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：室溫。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.黃芩苷；2.黃芩素；3.漢黃芩素；4.射干苷；5.次野鳶尾黃素Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed substance；B.test samples；C.negative control；1.baic-alin；2.baicalein；3.wogonin；4.tectoridin；5.irisflorentin

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別稱取BCL、BCN、WGN、TRD、IRT各適量，以甲醇制備成1 mg·mL-1的對(duì)照品貯備液，貯藏于－20℃，備用?；旌蠈?duì)照品溶液系列由上述各貯備液加入甲醇稀釋而成，稀釋濃度分別為1 000、1 000、1 000、2 000、2 000 ng·mL-1。

2.3 供試品溶液的制備

精密吸取1 mL射干合劑至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，超聲20 min，10 000 r·min-1離心6 min，吸取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后備用。

2.4 制備方法對(duì)樣品測(cè)定的影響

2.4.1 提取方法的比較 （1）有機(jī)溶劑提取法：精密吸取本品20 mL，加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至2，用醋酸乙酯振搖提取2次，每次30 mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状?0 mL使溶解，搖勻，再精密吸取1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。（2）超聲法：按“2.3”項(xiàng)下方法操作。

取2種方法制備的供試品溶液各20 μL進(jìn)樣，用色譜峰面積比較各黃酮類化合物的提取率。結(jié)果，除IRT、WGN 2種化合物的提取率無明顯區(qū)別外，TRD的提取率超聲法比有機(jī)溶劑提取法提高了25%，BCL、BCN更是提高了1倍以上，可見超聲法明顯優(yōu)于有機(jī)溶劑提取法。2種提取方法比較結(jié)果見表1。

表1 2種提取方法比較結(jié)果（n＝3）Tab 1 Comparison of 2 kinds of extraction processes of flavonoids（n＝3）

2.4.2 超聲時(shí)間對(duì)黃酮類化合物的影響 為了考察超聲時(shí)間對(duì)樣品中黃酮類化合物測(cè)定的影響，取射干合劑（批號(hào)：071201）1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分6份，分別在超聲0、1、5、10、20、30 min后取出樣品。結(jié)果表明，5種黃酮類化合物在20 min后基本趨于提取完全，所以本試驗(yàn)采用超聲提取20 min。超聲時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取率的影響見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)黃酮類化合物提取率的影響Fig 2 Effect of ultrasonic time on yield of flavonoids

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述混合對(duì)照品溶液0.012 5、0.125 0、1.250 0、6.250 0、12.500 0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋到刻度，搖勻，制成系列濃度為0.05～50 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。各取20 μL進(jìn)樣，以色譜峰峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度（C，μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其回歸方程分別為：

結(jié)果表明，上述5種化合物均在0.05～50 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.6 方法的回收率和重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密吸取射干合劑1 mL，精密加入BCL、BCN、WGN、TRD、IRT混合對(duì)照品溶液，每種化合物設(shè)計(jì)3個(gè)不同濃度，每個(gè)濃度制備3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，用9個(gè)測(cè)定結(jié)果評(píng)價(jià)方法的回收率，結(jié)果見表2。另外，對(duì)3個(gè)水平添加了混合對(duì)照品溶液的陰性樣品按同法檢測(cè)分析，連續(xù)5 d進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)，結(jié)果BCL、BCN、WGN、TRD、IRT的日間RSD分別為4.7%、3.2%、3.9%、4.6% 、5.3%。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2Results of recovery test（n＝9）

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取射干合劑供試品溶液，置室溫24 h，每隔4 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果，BCL、BCN、WGN、TRD、IRT的RSD分別為2.1%、1.8%、2.5%、1.6%、3.1%，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 專屬性試驗(yàn)

取無射干、黃芩的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液，按上述方法測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照不干擾BCL、BCN、WGN、TRD、IRT的測(cè)定，表明方法專屬性好。

3 討論

3.1 提取及測(cè)定方法的選擇

考慮到中藥成分的復(fù)雜性和不可預(yù)知性，應(yīng)盡可能地保留射干合劑樣品中更多色譜信息。本試驗(yàn)中的樣品處理不采用常見的溶劑提取等方法，而采用超聲提取法，能保留制劑中更多成分，避免了溶劑提取中藥中有效成分的損失[9]。

目前，對(duì)單一化合物的含量測(cè)定已有不少報(bào)道，對(duì)多組分的同時(shí)測(cè)定報(bào)道較少；文獻(xiàn)[10]認(rèn)為黃芩苷為黃芩素的7-O-葡糖醛酸結(jié)合物，黃芩苷類似于其它黃酮類化合物，存在吸收差的問題，并認(rèn)為可在人體腸道通過腸菌群水解為黃芩素后才被人體吸收。復(fù)方中藥制劑的多組分測(cè)定不僅是中藥質(zhì)量控制的重要方法[5]，也為中藥制劑的指標(biāo)成分與臨床療效間的相關(guān)性研究提供了一種科學(xué)方法。

3.2 色譜條件的優(yōu)選

由于IRT在本品中含量最低，所以在選擇檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí)盡可能優(yōu)先考慮其測(cè)定時(shí)的最大吸收。本試驗(yàn)用HPLC法能分離射干合劑中常見的黃酮類化合物TRD、BCL、BCN、IRT、WGN，故綜合上述各化合物的紫外吸收特點(diǎn)，選擇260 nm作為紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。選擇流動(dòng)相時(shí)，開始用甲醇、醋酸作流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)各化合物的峰形較寬，后改用乙腈、磷酸作流動(dòng)相，各化合物的峰形變窄；磷酸選擇1‰濃度，主要是因?yàn)閜H＜2容易使色譜柱損傷，而pH＞3則化合物峰形變寬；采用該流動(dòng)相梯度洗脫，所測(cè)定5種黃酮類化合物分離度好，保留時(shí)間分別為23.32、30.08、44.18、50.57、53.12 min。

綜上，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于射干合劑中黃酮類化合物多指標(biāo)成分的含量測(cè)定，也可用于其制劑及體內(nèi)指標(biāo)成分的研究。

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Content Determination of Multiple Indicator Constituents of Flavonoids inBelamcanda chinensisMixture by RP-HPLC

TANG Yue-nian，JIN Liang，ZHANG Jian，LU Xiao-tong（Dept.of Pharmacy，Xinhua Hospital of Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200092，China）

OBJECTIVE：To establish RP-HPLC method for the content determination of 5 kinds of multiple indicator constituents of flavonoids inBelamcanda chinensismixture such as baicalin.METHODS：Samples were extracted with selective ultrasound extraction.The separation was performed on Inertsil?ODS-3 column with mobile phase consisted of acetonitrile-1‰ phosphoric acid（pH＝2.25，gradient elution）at flow rate of 1 mL·min-1.The column temperature was room temperature and detection wavelength was set at 260 nm.The method was qualified by an external standard mode.RESULTS：The linear ranges of baicalin，baicalein，wogonin，tectoridin and irisflorentin were all 0.05～50 μg·mL-1（r≥0.998 9）with average recoveries of 96.52%～101.22%（RSD≤4.4%，n＝9）.CONCLUSION：This method is simple，convenient，accurate and sensitive for content determination of multiple indicator constituents of flavonoids inB.chinensismixture and constituent study of preparation and internal index constituent.

Flavonoids；RP-HPLC；Belamcanda chinensismixture；Content determination

R283.665；R927.2

A

1001-0408（2010）39-3714-03

2009-11-08

2010-03-08）