宋淑范，張曉曄

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第二腫瘤科，沈陽(yáng) 110004)

研究報(bào)告

博來(lái)霉素誘導(dǎo)G57BL/6與ICR小鼠肺間質(zhì)纖維化模型的比較

宋淑范，張曉曄

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第二腫瘤科，沈陽(yáng) 110004)

目的探討C57BL/6與ICR小鼠在博來(lái)霉素(BLM)致肺纖維化過(guò)程中的種屬差異。方法8周齡雌性C57BL/6小鼠19只，ICR小鼠16只，分別經(jīng)尾靜脈一次性注射BLM 150 mg/kg，觀察每組小鼠體重、生存率及肺組織病理改變。結(jié)果①C57BL/6與ICR小鼠最低體重分別發(fā)生在靜脈注射處置后的7 d和5 d，最低體重分別為注射前的65.46%和73.21%，兩組間無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②C57BL/6與ICR小鼠的生存率分別為36.84%和56.25%，兩組間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。③C57BL/6小鼠BLM注射后28 d，在胸膜下及血管周圍形成廣泛、穩(wěn)定的間質(zhì)纖維化病理改變，而ICR小鼠肺組織未見(jiàn)明顯纖維化形成。C57BL/6小鼠肺纖維化病理評(píng)分明顯高于ICR小鼠(P＜0.001)。結(jié)論BLM誘導(dǎo)的肺纖維化作用在C57BL/6與ICR小鼠間存在著明顯的種屬差異。C57BL/6小鼠較ICR小鼠更適于復(fù)制博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化動(dòng)物模型。

小鼠;近交C57BL/6;近交ICR;博來(lái)霉素;肺纖維化

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(IPF)的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，對(duì)其機(jī)制的研究和實(shí)驗(yàn)性治療，多依賴于動(dòng)物模型。BLM是一種細(xì)胞毒性藥物，具有致肺纖維化的作用，目前廣泛用于建立肺纖維化動(dòng)物模型。不同種屬的動(dòng)物對(duì)BLM致肺纖維化作用的反應(yīng)不同［1，2］，為建立肺間質(zhì)纖維化的動(dòng)物模型，我們比較了靜脈注射BLM在C57BL/6和ICR小鼠形成肺間質(zhì)纖維化的種屬差異。

C57BL/6小鼠是立特(Little)于1921年用艾比·拉特洛坡(Abby Lathrop)雌鼠57號(hào)與雄鼠52號(hào)交配而得C57BL，1937年從C57BL分離出C57BL/6亞系，是腫瘤學(xué)、生理學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)研究中常用的品系。ICR小鼠是Hauschka用Swiss小鼠群以多產(chǎn)為目標(biāo)，進(jìn)行選育，以后美國(guó)癌癥研究所分送各國(guó)飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，各國(guó)稱為ICR小鼠。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，靜脈注射BLM對(duì)C57BL/6小鼠與ICR小鼠肺組織損傷和間質(zhì)纖維化形成的作用有明顯差別。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的購(gòu)置與飼養(yǎng):C57BL/6小鼠，雌性、8周齡、體質(zhì)量17～20 g;ICR小鼠，雌性、8周齡、體質(zhì)量32～35 g，均購(gòu)于日本SLC株式會(huì)社。用可屏除抗原的過(guò)濾箱郵送，飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理:35只小鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)一周后，C57BL/6小鼠平均體質(zhì)量(17.44± 0.57)g，ICR小鼠平均體質(zhì)量(33.41±0.96)g，分別經(jīng)尾靜脈注射鹽酸BLM(日本化藥株式會(huì)社，制造號(hào):381480。溶于0.9%NaCl 200μL)150 mg/kg。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的觀察及標(biāo)本的采集:每日am 10.00，稱量小鼠體重，并觀察死亡情況。

1.2.2 肺組織病理檢查:小鼠尾靜脈注射處置后28 d，每組取5只小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動(dòng)脈放血處死，開(kāi)胸，向左肺灌注4%甲醛，直至肺表面平滑，結(jié)扎左支氣管，取出左肺，放入4%甲醛中固定。石蠟包埋，切片(4 μm)行Masson's trichrome染色。

1.2.3 肺組織病理評(píng)分:利用Ashcroft［3］的方法，進(jìn)行肺纖維化嚴(yán)重度的形態(tài)學(xué)半定量分析［4］。簡(jiǎn)言之，將肺組織病理由0(正常組織)至6(最嚴(yán)重的纖維化病變)分7個(gè)等級(jí)，每只小鼠隨機(jī)取5個(gè)肺組織HE染色片，每片在100倍視野下，觀察30個(gè)連續(xù)視野，其平均值為該鼠纖維化的等級(jí)評(píng)分。兩位觀察者雙盲觀察評(píng)分的平均值，作為纖維化等級(jí)的最終得分。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠體重變化

C57BL/6小鼠在第7天、ICR小鼠在第5天時(shí)體重降至最低，分別為(11.41±1.57)g和(24.46 ±1.67)g，分別是靜脈注射BLM前體重的65.46%和73.21%。兩組小鼠最低體重均較BLM注射前顯著降低(P＜0.001)。見(jiàn)圖1。

DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液(15 mg/3 mL)購(gòu)自山東先聲麥得津生物制藥有限公司，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)染色劑購(gòu)自武漢博士德公司，DDP注射液(10 mg/2 mL)購(gòu)自云南個(gè)舊生物藥業(yè)有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司。

注:C57BL/6小鼠在第7天、ICR小鼠在第5天時(shí)體重降至最低，與第1天小鼠體重比較，體重均明顯減輕(**:與第一天比較，P＜0.001)。圖1兩組小鼠體重變化曲線Note:After intravenous injection of bleomycin，both the C57BL/6 and ICR mice show weight loss gradually，reaching a maximum at the 7 th and the 5 th day，respectively.(**: compare with the first day，P＜0.001)Fig.1 The curves of body weight changes in the two groups

2.2 兩組小鼠生存率比較

尾靜脈注射處置后，C57BL/6小鼠于第7天、ICR小鼠于第11天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，第16天后兩組均無(wú)死亡發(fā)生，C57BL/6小鼠與ICR小鼠的生存率分別為36.84%和56.25%，兩組間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。

2.3 小鼠肺組織病理學(xué)改變

C57BL/6組小鼠第28天在胸膜下及血管周圍可見(jiàn)多處肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺實(shí)質(zhì)呈大片融合實(shí)變，其間有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，形成廣泛、穩(wěn)定的纖維化(圖2)。ICR組小鼠肺組織病理未見(jiàn)明顯纖維化改變(圖3)。圖2，3見(jiàn)彩插2。

2.4 兩組小鼠肺組織病理評(píng)分

C57BL/6組與ICR組小鼠尾靜脈注射處置后第28天，肺組織纖維化病理評(píng)分分別為(5.4± 0.25)和(1.0±0.08)，C57BL/6組小鼠顯著高于ICR組小鼠(P＜0.001)。

3 討論

至今為止，IPF的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，對(duì)其機(jī)制的研究，目前常利用BLM復(fù)制的肺間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型，C57BL/6及ICR小鼠均對(duì)BLM致肺纖維化作用敏感，均可用于制作肺間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型［1，2，5］。經(jīng)氣管滴入BLM雖是目前常用的肺纖維化動(dòng)物模型復(fù)制方法［6］，但該方法需進(jìn)行氣管切開(kāi)，操作比較復(fù)雜，且存在一定的感染風(fēng)險(xiǎn)。經(jīng)尾靜脈注射BLM亦可制作肺間質(zhì)纖維動(dòng)物模型，該方法操作簡(jiǎn)單，需時(shí)短，并可避免由于手術(shù)操作而引發(fā)的感染。

我們的結(jié)果顯示，尾靜脈注射BLM(150 mg/ kg)后第28天，C57BL/6小鼠肺間質(zhì)形成了大片纖維化病理改變，而ICR小鼠肺組織未見(jiàn)明顯病理改變，其纖維化病理評(píng)分分別為(5.4±0.25)和(1± 0.08)(P＜0.001)。提示靜脈注射BLM后C57BL/ 6較ICR小鼠更易形成肺間質(zhì)纖維化。

ICR小鼠在靜脈注射150 mg/kg的BLM后，未形成肺間質(zhì)纖維化改變，推測(cè)可能與注射劑量較小有關(guān)，因同樣劑量BLM注射后，C57BL/6小鼠生存率為36.84%，而ICR小鼠的生存率為56.25%，明顯高于C57BL/6小鼠，說(shuō)明ICR小鼠對(duì)BLM的耐受性明顯高于C57BL/6小鼠。Li等［7］應(yīng)用100 mg/ kg的BLM靜脈注射成功復(fù)制了ICR小鼠肺纖維化的動(dòng)物模型，這與我們?cè)趧┝可洗嬖谥^大的差別，推測(cè)可能與用藥的藥物活性和小鼠的亞種，以及小鼠的周齡不同有關(guān)。劉珊等［8］以6 mg/kg的BLM通過(guò)氣管內(nèi)給藥成功復(fù)制了ICR小鼠肺纖維化的動(dòng)物模型。這都說(shuō)明ICR小鼠亦可用于肺間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型的復(fù)制。

雖然C57BL/6小鼠體重明顯較ICR小鼠輕，會(huì)給一些需要更大質(zhì)量肺組織的研究帶來(lái)不便，但由于C57BL/6較ICR小鼠更易形成肺間質(zhì)纖維化，因而如果不需要更大質(zhì)量的組織，我們建議使用C57BL/6小鼠來(lái)復(fù)制小鼠肺間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型。

利用尾靜脈注射BLM的方法制作肺間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型，其肺病理改變主要分布于胸膜下及血管周圍，這與臨床IPF病理分布更為接近，因而建議在科研中盡量應(yīng)用該方法來(lái)進(jìn)行肺間質(zhì)纖維化的研究。

(本文圖2，3見(jiàn)彩插2。)

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Com parison of the Effects of Bleom ycin on the Induction of Pu lm onary Fibrosis in C57BL/6 and ICR M ice

SONG Shu－fan，ZHANG Xiao－ye
(The Second Department of Oncology，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110021，China)

ObjectiveTo investigate the species differences between C57BL/6 and ICR m ice in the establishment of models of pulmonary fibrosis induced by bleomycin(BLM).M ethods The experiment was carried out in 19 8－week old female C57BL/6 and 16 8－week old female ICR mice by injection of 150 mg/kg BLM via the tail vein，and the mice were killed at 4 weeks after BLM injection.The body weight，survival rate，and histological changes of the lungs in each group were examined.Results①The lowest weight of the C57BL/6 m ice occurred on the 7 th day and was 65.46%of their original weight before BLM injection，and that in the ICR mice was 73.21%at the 5th day，with a nonsignificant difference between the two groups.②The survival rate of the C57BL/6 mice was 36.84%，and the ICR m ice was 56.25%，with a significant difference between the two groups.③Pulmonary interstitial fibrosis was widely and stably formed under the pleura and around the vasculature，in C57BL/6 mice at the 28th day after BLM administration，but no significant fibrosis formed in the ICR mice.Compared with the ICR mice，the pathologic scores of the pulmonary fibrosis in C57BL/6 mice was significantly higher(P＜0.001).ConlusionThe effect of bleomycin in the induction of pulmonary fibrosis in C57BL/6 and ICR mice shows a distinct species differences.C57BL/6 mouse is more suitable for the preparation of pulmonary fibrosis models induced by BLM.

C57BL/6 mouse;ICR mouse;Bleomycin;Pulmonary fibrosis

R361

A

1005－4847(2010)04－0289－03

2009－12－30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30100076;30570812);遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20042085)基金資助。

宋淑范(1981－)，女，碩士研究生，研究方向:肺間質(zhì)纖維化。

張曉曄，E－mail:zh_yd@126.com