吳玉泓，魏彥明，郭延生

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)課部，蘭州 730000)

研究報告

大鼠實(shí)驗(yàn)性流產(chǎn)模型的建立及黃芪多糖對其的影響

吳玉泓1，2，魏彥明1，郭延生1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)課部，蘭州 730000)

目的應(yīng)用細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)尾靜脈注射建立大鼠實(shí)驗(yàn)性流產(chǎn)動物模型，研究黃芪多糖(astragalus polysacharin，APS)對實(shí)驗(yàn)性流產(chǎn)大鼠保胎的作用。方法采用懷孕第7天Sprague–Daw ley (SD)大鼠尾靜脈注射LPS每只1.0 μg，建立實(shí)驗(yàn)性大鼠流產(chǎn)模型，以正常懷孕大鼠尾靜脈注射磷酸緩沖液(PBS)每只1.0 m L作為對照組，隨機(jī)將模型組大鼠分為流產(chǎn)模型組、APS組。APS組于懷孕4～9 d口服APS 2 m L (150mg)/d，對照組與和流產(chǎn)模型組分別于4～9 d口服生理鹽水2 mL/d。于實(shí)驗(yàn)第10天麻醉處死各組大鼠，計數(shù)妊娠成功比例和流產(chǎn)比例。結(jié)果LPS誘導(dǎo)大鼠流產(chǎn)模型組流產(chǎn)比例高達(dá)8/11，而對照組和APS組流產(chǎn)比例分別為1/12和1/6，與流產(chǎn)模型組比較差異極顯著(P＜0.01)。結(jié)論LPS可以誘導(dǎo)建立大鼠流產(chǎn)模型，中藥成分APS對實(shí)驗(yàn)性大鼠流產(chǎn)具有一定的保護(hù)作用。

大鼠;細(xì)菌脂多糖;流產(chǎn)模型;黃芪多糖

早期胚胎死亡或胚胎丟失，又稱隱性流產(chǎn)，嚴(yán)重影響母畜繁殖力與生產(chǎn)力。有研究表明，哺乳動物著床后的胚胎大約有40%～60%不能發(fā)育到正常分娩便發(fā)生死亡，其中早期胚胎死亡約占2/3［1，2］。人的妊娠約75%以失敗而告終，由于大部分發(fā)生在圍著床期，即多數(shù)為早期流產(chǎn)，因此也稱為自然流產(chǎn)(spontaneous abortion，SA)，由于無明顯癥狀或僅表現(xiàn)為月經(jīng)過多或合并月經(jīng)延遲，因此，并未引起患者和臨床醫(yī)師的重視［3］。國內(nèi)資料介紹，牛的早期胚胎丟失率在38%，豬、羊約在30%左右［4］。轉(zhuǎn)基因動物研究在基因構(gòu)建、顯微注射等方面耗費(fèi)巨資，但是胚胎移植給受體后的成活率不高，造成了極大的人力、物力的浪費(fèi)。荷蘭Leiden大學(xué)所做轉(zhuǎn)基因牛的研究結(jié)果是，發(fā)育良好的胚胎移入受體子宮后的成活率為14.7%［5］;國內(nèi)揚(yáng)州大學(xué)研究轉(zhuǎn)基因牛、羊，其胚胎成活率也僅為12.8%［5］。顯然，反復(fù)自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是困擾生殖生物學(xué)家的難題之一，雖然其主要原因有基因缺陷、解剖異常、內(nèi)分泌紊亂和感染，但60%～70%的流產(chǎn)難以解釋其發(fā)生的原因［6］。Zhal和Bjerknes (1943)、Rieder和Thomas(1960)及Mokay和Wong (1963)的研究表明，細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)能夠誘發(fā)大鼠和小鼠的胚胎吸收［7－9］。因此，本研究應(yīng)用LPS尾靜脈注射以建立實(shí)驗(yàn)性流產(chǎn)大鼠動物模型，并應(yīng)用中藥成分黃芪多糖(astragalus polysacharin，APS)干預(yù)，以研究早期流產(chǎn)的發(fā)生原因和APS對其的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選擇12周齡未經(jīng)產(chǎn)Sprague－Daw ley(SD)雌性大鼠100只，體質(zhì)量202～238 g，雄性SD大鼠50只，均來源于甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心【醫(yī)動字SCXK(甘)2004－2006】。實(shí)驗(yàn)動物常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食和飲水，每日光照12 h，適應(yīng)環(huán)境1周后，陰道涂片法進(jìn)行發(fā)情鑒定，選用有4d左右正常性周期的大鼠，根據(jù)陰道涂片確定發(fā)情期的不同階段。

1.2 藥品、試劑

APS:取干燥黃芪飲片(甘肅岷縣，經(jīng)本研究室鑒定)，分離、提取，含量為78%。

LPS(北京經(jīng)科化學(xué)試劑經(jīng)營公司，Sigma L－6386)。

1.3 大鼠妊娠的確定

選擇發(fā)情周期正常的未經(jīng)產(chǎn)雌性大鼠，于前1 d pm 19:00按雌雄2∶1合籠，次日am 7:00按檢查陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子者定為妊娠第1天。

2 大鼠實(shí)驗(yàn)性流產(chǎn)模型的建立預(yù)實(shí)驗(yàn)

2.1 建模方法及結(jié)果

選擇雌性SD大鼠30只，雄性15只，按雌雄2∶1合籠，次日am 8:00～9:00檢查陰道內(nèi)有精子者定為妊娠第1天，將32只陰道檢出精子的母鼠分別按表1方法進(jìn)行處理，以確定大鼠實(shí)驗(yàn)性流產(chǎn)模型建立的方法。各組實(shí)驗(yàn)大鼠用不同劑量的LPS在妊娠不同天數(shù)處理后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。從表1可以看出，尾靜脈注射LPS可引起妊娠大鼠流產(chǎn)，注射0.5 μg時很少發(fā)生流產(chǎn);不論妊娠第5天還是第7天，注射1.5 μg LPS時可導(dǎo)致絕大多數(shù)妊娠大鼠流產(chǎn)，子宮內(nèi)無胎兒，無法計算死胎數(shù);妊娠第5天或第7天靜脈注射1.0 μg LPS，可引起妊娠大鼠流產(chǎn)，以妊娠第7天注射LPS，妊娠第10天剖檢可導(dǎo)致全部妊娠大鼠流產(chǎn)。因此，實(shí)驗(yàn)選擇妊娠第7天尾靜脈注射LPS 1.0 μg，第10天剖檢。

2.2 正常胚胎、流產(chǎn)胚胎的判定標(biāo)準(zhǔn)

參照Clark(1980)等［1］的方法，即正常胚胎:子宮內(nèi)無瘀血，胚胎發(fā)育良好，個體較大，呈淡紅色;流產(chǎn)胚胎:剖檢時子宮呈“竹節(jié)狀”，胚胎體積明顯縮小，子宮內(nèi)胚胎呈黑褐色，胎兒胎盤有明顯的出血或壞死。

流產(chǎn)率=流產(chǎn)動物數(shù)/(流產(chǎn)動物數(shù)+未流產(chǎn)動物數(shù))×100%

3 APS含量測定和應(yīng)用劑量的確定

3.1 APS總糖含量測定

常規(guī)水提醇沉的方法提取APS，除蛋白，冷凍干燥得APS。按以下方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定APS含量。①精密稱取105℃干燥至恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，置100 m L容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。②精密汲取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 m L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別置于50 m L容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。③精密汲取上述各種溶液2.0 mL，迅速加入5%草酚溶液1.0 m L，搖勻，再迅速加入濃硫酸5.0 m L，振搖5 min，置沸水浴上加熱15 min，然后置冷水浴中冷卻30 min。④在分光光度計490 nm處測定吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)，吸光度值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見圖1。APS樣品含量測定及結(jié)果:①精密稱取APS樣品50 mg，于50 m L容量瓶定容至刻度。②精密汲取APS樣品液2 m L，置50 m L容量瓶定容，搖勻。③精密汲取以上溶液2 m L，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法操作，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量，多糖糖含量為78%。④應(yīng)用紫外分析儀檢測，在260 nm和280 nm處未見吸收峰，說明不含蛋白質(zhì)和核酸。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

3.2 APS劑量的確定

根據(jù)大鼠與人的用藥量換算公式［10］，按每只大鼠體重200 g，每日灌胃2 mL進(jìn)行計算，每只大鼠每天的APS用量相當(dāng)于50 kg體重的成人每日兩劑的藥量。

4 流產(chǎn)模型的建立及APS的作用

4.1 實(shí)驗(yàn)方法

按預(yù)實(shí)驗(yàn)相同的方法，選擇陰道涂片發(fā)現(xiàn)精子的大鼠36只，按表2分組實(shí)驗(yàn)。

表1 大鼠實(shí)驗(yàn)性流產(chǎn)動物模型的建立預(yù)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Tab.1 The development and results of the preliminary experiment of LPS－induced abortion in rats

表2 實(shí)驗(yàn)性大鼠流產(chǎn)模型的建立及中藥作用的實(shí)驗(yàn)方法(m L)Tab.2 Experimental methods of establishment of the rat model of LPS－induced abortion and the effect of the Chinese herbs

4.2 各組大鼠妊娠成功率及流產(chǎn)率

如表3所示，流產(chǎn)模型組妊娠成功比例為3/ 11，對照組妊娠成功比例為11/12，APS組妊娠成功比例為5/6。對照組與APS組比較差異不顯著(P＞0.05);對照組和APS組與流產(chǎn)模型組比較均具有極顯著性的差異(P＜0.01)。

表3 實(shí)驗(yàn)性大鼠流產(chǎn)模型的建立及APS對其影響Tab.3 Effects of the Chinese herbs on the LPS－induced abortion in rats

5 討論

流產(chǎn)是指由于胎兒或母體異常而導(dǎo)致妊娠的生理過程發(fā)生紊亂，或它們之間的正常關(guān)系受到破壞而導(dǎo)致的妊娠中斷，雖可以發(fā)生在妊娠的各個階段，但以妊娠早期較為多見。各種家畜均可發(fā)生流產(chǎn)，尤其是早期胚胎死亡在流產(chǎn)中占有相當(dāng)大的比例，各種動物均可發(fā)生，如馬妊娠60d之前，胚胎死亡率可達(dá)18%。在動物早期胚胎死亡和反復(fù)自然流產(chǎn)的結(jié)果是導(dǎo)致屢配不孕或發(fā)情推遲以及妊娠率降低，嚴(yán)重影響動物的生產(chǎn)性能［6］。

黃芪是一種補(bǔ)氣藥物，含有多糖、生物堿、氨基酸、黃酮類、甙類、微量元素等多種生物活性物質(zhì)，其中APS的免疫活性尤為突出?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃芪除能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，促進(jìn)細(xì)胞代謝，調(diào)節(jié)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成外，還兼有固腎降壓、保肝消炎等功效。目前，APS已開始陸續(xù)應(yīng)用于獸醫(yī)臨床，能提高動物的抗病能力，降低發(fā)病率。但關(guān)于降低實(shí)驗(yàn)動物流產(chǎn)發(fā)生率的研究未見報道。

本研究應(yīng)用LPS尾靜脈注射成功的建立了大鼠實(shí)驗(yàn)性流產(chǎn)動物模型，為進(jìn)一步研究引起早期流產(chǎn)的發(fā)生原因提供了依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，流產(chǎn)模型組于懷孕第7天尾靜脈注射LPS1.0 μg流產(chǎn)比例達(dá)8/11，同期對照組流產(chǎn)比例僅為1/12，兩者之間差異極顯著(P＜0.01);APS干預(yù)組流產(chǎn)比例為1/6，與流產(chǎn)模型組之間有著顯著性差異(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)同時發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)模型具有Th1和Th2輔助性細(xì)胞因子分泌失調(diào)表現(xiàn)，即LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)模型表現(xiàn)為Th1細(xì)胞因子作用增強(qiáng)而Th2細(xì)胞因子作用降低，Th1細(xì)胞因子的分泌與作用超過并阻斷了Th2細(xì)胞因子的分泌與作用，而正常對照組和APS干預(yù)組則相反，雌孕激素受體發(fā)生變化和明顯的子宮局部或全身的病理變化(另文報道)。LPS可以誘發(fā)大鼠、小鼠的胚胎吸收或流產(chǎn)，其誘導(dǎo)流產(chǎn)的一個重要機(jī)制是引起預(yù)敏(primed)的巨噬細(xì)胞(Mф)釋放TNF－α［11］。Mф受到IFN－γ刺激預(yù)致敏后，少量的LPS就會使之釋放TNF－α［12］。同時，LPS本身也可刺激人外周血單核細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞釋放IFN－γ［13，14］。這就說明，LPS既能使被IFN－γ預(yù)致敏的Mф產(chǎn)生TNF－α，又可以直接誘導(dǎo)IFN－γ的生成，而IFN－γ使更多的Mф致敏，使得TNF－α的生成量極大的增多。本研究對LPS誘導(dǎo)流產(chǎn)模型大鼠細(xì)胞因子的測定也證明了上述研究結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在妊娠第7天尾靜脈注射LPS 1.0 μg/m L，可引起妊娠大鼠8/11的流產(chǎn)率，達(dá)到了流產(chǎn)模型建立的目的，與對照組和APS干預(yù)組有極顯著的差異。表明LPS通過激活體內(nèi)和子宮局部Th1型細(xì)胞因子的過度表達(dá)引起早期胚胎吸收或流產(chǎn)，與前人的實(shí)驗(yàn)和臨床研究報道自然流產(chǎn)或習(xí)慣性流產(chǎn)有Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)增強(qiáng)的結(jié)果一致［13－15］，而所選中藥成分APS能夠降低流產(chǎn)發(fā)生率。

［1］Clark DA，McDermott M，Sczewzuk MR.Impairment of host vs graft reaction in pregnant mice.II.Selective suppression of cytotoxic cell generation correlates with soluble suppression activity and with successful allogeneic pregnancy［J］.Cell Immunol，1980，52:106－114.

［2］Baines MG，Duclos AJ，Antecka E.et al.Decidual infiltration and activation of macrophages leads to early embryo loss［J］.Am J Reprod Immunol，1997，37:471－477.

［3］Mishell DR Jr.Recurrent abortion［J］.J Reprod Med，1993，38:250－259.

［4］趙興緒.獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

［5］田小利，陳蘭英.轉(zhuǎn)基因動物原理:技術(shù)與應(yīng)用［M］.吉林科技出版社，1995.

［6］Coulam CB.Immunotherapy for recurrent spontaneous abortion［J］.Early Pregnancy，1995，1(1):13－26.

［7］Zahl PA，Bjerknes C.Induction of decidual－placental hemorrhage in mice by the endotoxins of certain Gram negative bacteria［J］.Proc Soc Exp Biol Med，1943，54:329－332.

［8］Rieder RT，Thomas L.Studies of the mechanism involved in the production of abortion by endotoxin［J］.J Immunol，1960，84: 189－193.

［9］Mokay SG，Wong FC.Effect of bacterial endotoxins on the p lacenta of the rat［J］.Am J Pathol，1963，42:357－372.

［10］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)(第2版)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1994.178－180.

［11］Beutler B，Greenwald D，Hulmes JD，et al.Identity of tumor necrosis factor and the marcrophage－secreted factor cachectin［J］.Nature Lond，1985，316:552－554.

［12］Gifford GE，Lohmann－mathes ML.Gamma interferon priming of mouse and human macrophages for production of tumor necrosis factor by bacterial lipopolysaccharide［J］.J Natn Cancer Inst，1987，78:121－124.

［13］Le J，Lin JX，Henriksen－Destefano D，et al.Bacterial lipopolysaccharide－induced interferon－gamma production:roles of interleukin 1 and interleukin 2［J］.J Immunol，1986，4525－4530.

［14］Blanchard DK，Djeu JK，K lein TW，et al.Interferon－gamma induction by lipopolysaccharide:dependence on interleukin 2 and macrophges［J］.J Immunol，1986，136:963－970.

［15］Parand M，Chedid L.Protective effect of chlorpromazine against endotoxin induced abortion［J］.Proc Soc Exp Biol Med，1964，116:906－909.

Establishm ent of a LPS-Induced Rat M odel of Abortion and the Effect of Astragalus Polysacharin on It

WU Yu－h(huán)ong1，2，WEI Yan－m ing1，GUO Yan－sheng1
(1.Faculty of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;
2.School of Basic Medical Sciences，Gansu College of Traditional Chinese medicine，Lanzhou 730000)

ObjectiveTo investigate the anti－abortional effect of astragalus polysacharin(APS)on experimental aborting rats.M ethods Sprague－Dawley(SD)rats injected with lipopolysaccharides(LPS)1 μg per rat in tail vein on day 7 of pregnancy were used as aborting model，and the other injected with phosphate buffer solution(PBS)1.0 m L per rat were used as normal group.The aborting rats were random ly divided into 3 groups:the control group，the abortion model group and the group treated with astragalus polysaccharin.The control group and abortion model group were given normal saline 2 mL from day 4 to day 9 of pregnancy via gastrogavage.The treated group was given astragalus polyaccharin 2 m L via gastrogavage during the same period.All the rats were killed on day 10 of pregnancy，and the abortion rates were assessed.ResultsA high miscarriage rate up to 8/11 was observed in the LPS induced abortion group in contrast to 1/12 in the control group.ConlusionLPS－induced abortion rate in rats can be decreased by treatment with astragalus polyaccharin.

Rats;Lipopolysaccharides;Abortion model;Astragalus polyaccharin

S857.2+1，R392.7

A

1005－4847(2010)04－0341－04

2010－03－22

高等學(xué)校博士點(diǎn)科學(xué)研究基金(20060733007)資助項(xiàng)目。

吳玉泓(1967－)，男，副教授，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)在讀博士，研究方向:中藥藥理與消化系統(tǒng)疾病研究。E－mail:yhw67@126.com。

魏彥明(1963－)，教授，博士生導(dǎo)師，從事中獸醫(yī)醫(yī)藥學(xué)和臨床獸醫(yī)學(xué)教學(xué)、科研工作。E－mail:weiym@gsau.edu.cn。