周丹英，余琪，錢冬偉，朱琦

(浙江省中藥研究所，浙江杭州 310023)

喘立停氣霧劑中麻黃堿提取和純化工藝的研究

周丹英，余琪，錢冬偉，朱琦

(浙江省中藥研究所，浙江杭州 310023)

麻黃;正交試驗(yàn);麻黃總堿;提取率;有機(jī)溶劑;萃取

目的:研究從麻黃草中提取麻黃堿的工藝;選擇適宜的萃取溶劑、萃取次數(shù)等，以得到較高純度的麻黃堿。方法:采用正交試驗(yàn)法進(jìn)行麻黃的提取工藝優(yōu)選，利用高效液相色譜法測(cè)定麻黃堿的含量。結(jié)果:在研究的幾個(gè)因素中，提取次數(shù)對(duì)提取率有顯著性影響，對(duì)麻黃堿含量有較大影響。結(jié)論:最佳提取工藝為藥材8倍量水回流提取，提取2次，每次提取2 h;純化工藝則選擇用乙醚作為萃取溶劑，用與堿化后麻黃浸膏等體積的乙醚萃取3次，回收乙醚即可得到麻黃總堿浸膏，其純度達(dá)到85%以上。該方法提取率高，準(zhǔn)確穩(wěn)定，易于操作。

麻黃為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinicaStapf、中麻黃Ephedra intermediaSchrenk et C.A.Mey.或木賊麻黃Ephedra equisetina Bag.的干燥草質(zhì)莖［1］。味辛、微苦，性溫，具發(fā)汗散寒、宣肺平喘、利水消腫之功效。其主要化學(xué)成分為麻黃堿、偽麻黃堿。

“喘立?！碧幏綖榕R床使用多年的經(jīng)驗(yàn)方，將麻黃、細(xì)辛、椒目、艾葉等藥材合理組合配伍使用，用于治療哮喘，控制哮喘發(fā)作時(shí)的癥狀，具有良好的臨床效果。作為平喘用藥，其作用的主要靶部位是肺，而吸入療法是哮喘治療的首選方法之一［2］，可避免肝臟及胃腸道的首過(guò)作用，吸收后迅速進(jìn)入體循環(huán)，作用快，劑量小，副作用?。?］，因此我們選擇氣霧劑進(jìn)行本新藥的研究。本論文主要研究麻黃藥材中麻黃總堿的提取和純化工藝研究，以確定最佳麻黃堿提取工藝和純化工藝。

為探討麻黃提取工藝的科學(xué)性，我們以麻黃總堿、提取率為指標(biāo)，采用水加熱提取，正交試驗(yàn)優(yōu)選其提取工藝的最佳條件。同時(shí)，建立了麻黃堿的含量測(cè)定方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1100高效液相色譜儀(安捷倫公司);DH9140－3鼓風(fēng)電熱恒溫干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司);senco r－501－旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司);lambda20紫外分光光度儀(PE):AB204－5電子天平(Mettler Tolldo); KQ100－DB數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥鹽酸麻黃堿對(duì)照品、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為17124－200303，171237－200304)。麻黃藥材，購(gòu)于亳州新興中藥材飲片有限公司，經(jīng)鑒定為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinicaStapf的干燥草質(zhì)莖;甲醇(分析純)、乙腈(色譜純)。

2 實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1 麻黃總堿含量測(cè)定方法［4］

2.1.1 色譜條件選擇以十八烷基鍵合硅膠為填充劑;色譜柱C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈－0.2%磷酸溶液(4∶96)，流速1.0 mL/ min，柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm。外標(biāo)法測(cè)定麻黃堿含量。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取真空干燥至恒重的鹽酸麻黃堿對(duì)照品和鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相溶解，制成每1 mL約含150 μg鹽酸麻黃堿和50 μg鹽酸偽麻黃堿的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.1.3 線性關(guān)系考察精密稱取鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶解并定容，得到每1 mL含0.148 8 mg鹽酸麻黃堿和0.048 mg鹽酸偽麻黃堿，按上述色譜條件進(jìn)樣量分別為2、4、6、8、10、20、30 μL測(cè)定。以峰面積為橫坐標(biāo)(X)，鹽酸麻黃堿進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行回歸，得回歸方程Y=0.007 7X+0.007 2(R=0.999 9)。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿在0.297 6～4.464 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。以峰面積為橫坐標(biāo)(X)，鹽酸偽麻黃堿進(jìn)樣量為縱坐標(biāo)(Y)，得回歸方程為Y=0.000 81X+0.003 4(R=0.999 9)。結(jié)果顯示鹽酸偽麻黃堿在0.096～1.44 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn)精密吸取上述對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，鹽酸麻黃堿平均峰面積為3 865.2，RSD為0.06%(n=5)，鹽酸偽麻黃堿平均峰面積為1 191.6，RSD為1.349%。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)按擬定的方法對(duì)同一樣品進(jìn)行6次平行供試品溶液制備與測(cè)定。結(jié)果鹽酸麻黃堿平均含量RSD=1.49%(n=6)，鹽酸偽麻黃堿RSD=2.97%(n=6)。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn)精密稱取已知含量的供試品，分別精密加入鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的混合對(duì)照品(濃度分別為0.80 mg/mL、0.29 mg/mL)1 mL，制成供試品溶液，依法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算。鹽酸麻黃堿平均回收率為98.78%，RSD為1.95%;鹽酸偽麻黃堿平均回收率為98.77%，RSD為1.64%。

2.1.7 供試品溶液的制備、測(cè)定取正交試驗(yàn)樣品1～9號(hào)，精密吸取樣品溶液1.0 mL，置25 mL量瓶中，加流動(dòng)相［乙腈－0.2%磷酸溶液(4∶96)］稀釋至刻度，超聲提取20 min，取出，搖勻后用0.45 μm的微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.2 提取率的測(cè)定［5］精密吸取樣品溶液10 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，將其水浴蒸干后，置于同一恒溫箱中，105℃干燥3 h，取出后置干燥器內(nèi)冷卻30 min，分別精密稱重，計(jì)算提取率。

2.3 麻黃堿的提取

2.3.1 提取溶媒的確定麻黃堿屬苯異丙胺衍生物，可溶于水、乙醇、乙醚等溶劑中，因此可采用水提、醇提、醚提等方法。目前醫(yī)院制劑室提取麻黃生物堿方法有3種，即水蒸汽蒸餾法、酸水溫浸法、酸水煮提法［6］。作者對(duì)酸水、水、稀乙醇提取麻黃總堿作了比較，按常規(guī)提取條件進(jìn)行:每份取100 g麻黃藥材，提取2次、每次2 h，每次用10倍量提取溶媒，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 幾種方法提取麻黃的比較

各方法所得麻黃堿含量和提取率差異不是非常明顯，我們從對(duì)設(shè)備的要求和操作安全性考慮，認(rèn)為還是選擇用水加熱提取法比較合適。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)方法分別稱取麻黃100 g 9份，按正交試驗(yàn)表選擇的條件進(jìn)行提取，合并提取液，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮至一定體積V，作為樣品溶液。

2.3.3 試驗(yàn)安排選擇提取次數(shù)、提取時(shí)間、溶媒用量3個(gè)因素，按下表進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。

表2 試驗(yàn)因素水平表

2.3.4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析按以下正交試驗(yàn)安排表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，麻黃總堿和提取率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表試驗(yàn)數(shù)據(jù)

分別對(duì)有關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作極差和方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。A因素對(duì)提取率有顯著性影響，對(duì)麻黃總堿含量也有較大影響。以上各因素對(duì)提取率來(lái)說(shuō)影響程度依次為A＞C＞B，而對(duì)麻黃總堿來(lái)說(shuō)依次為A＞B＞C。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和從省時(shí)節(jié)能、降低成本的角度考慮，優(yōu)選出最佳提取工藝為A2B2C2，即麻黃的提取工藝確定為:麻黃藥材8倍量水提取2次，每次提取2 h。

表4 極差分析

表5 方差分析

2.3.5正交驗(yàn)證試驗(yàn)稱取100 g麻黃藥材各3份，按上述優(yōu)選出的提取條件進(jìn)行試驗(yàn)，分別測(cè)定各樣品的提取率(%)和麻黃總堿總量(mg)。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 正交驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，按正交試驗(yàn)優(yōu)選出的提取條件切實(shí)可行，重現(xiàn)性良好。

2.4 麻黃總堿的精制和純化

2.4.1 麻黃提取液中麻黃總堿萃取溶劑的確定麻黃經(jīng)提取、濃縮后得到的是麻黃浸膏(密度為1.1左右)，而喘立停作為氣霧劑則需要得到較高純度的麻黃堿，因此必須進(jìn)行麻黃堿的純化和精制。根據(jù)麻黃堿的性質(zhì)我們?cè)捎昧思妆胶捅健⒙确?、乙醚等有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。因考慮到部分有機(jī)溶劑操作上的安全性和藥用的安全性，最后選擇無(wú)水乙醚作為溶劑。2005版藥典中乙醚是二級(jí)溶劑，因此我們做了麻黃堿中乙醚殘留量測(cè)定。

2.4.2 麻黃總堿萃取次數(shù)的確定取出304 g麻黃浸膏，測(cè)得麻黃總堿含量為20.66 mg/g，加入20%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至12，分別加堿化后藥液等體積的無(wú)水乙醚萃取4次，分別測(cè)定每次乙醚萃取液中鹽酸麻黃總堿含量。經(jīng)檢測(cè)分析:第1次萃取液中含5 556 mg麻黃總堿，第2次萃取液含741 mg，第3次萃取液含364 mg，第4次萃取液中已經(jīng)檢測(cè)不到麻黃總堿。

結(jié)果:麻黃藥液用乙醚萃取3次，鹽酸麻黃總堿回收率可達(dá)97.67%。因此選擇每次用與堿化后浸膏等體積的乙醚萃取3次，萃取液回收乙醚后置水浴上蒸干可得到較高純度的麻黃總堿。

2.5 麻黃總堿中乙醚殘留量測(cè)定

2.5.1 方法照氣相色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄ⅥE.)測(cè)定。

色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜柱:HP－5(5%苯基甲基硅酮)(30 m×320 μm×0.25 μm);柱溫:起始為35℃，維持4 min，再以30℃/min升至180℃，維持5 min，再以30℃/min降至35℃，維持2 min;進(jìn)樣口溫度:200℃;檢測(cè)器溫度:250℃;載氣:高純氮;分流比50∶1;檢測(cè)器:FID(空氣流速450 mL/min，氫氣流速45 mL/min);進(jìn)樣量:1 μL。

對(duì)照品溶液的制備精密稱取乙醚適量，加二甲基甲酰胺溶解，制成每1 mL約含0.5 mg乙醚的溶液，作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備精密取本品0.1 g，加二甲基甲酰胺溶解定容至5 mL，作為供試品溶液。

測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.5.2 樣品測(cè)定數(shù)據(jù)見(jiàn)表7。

表73 批麻黃堿樣品乙醚含量(n=3)

從上表得知，無(wú)水乙醚萃取后得到的麻黃堿浸膏經(jīng)檢測(cè)沒(méi)有乙醚殘留。

綜上所述，麻黃提取、純化工藝確定為:麻黃藥材8倍量水提取2次，每次2 h，提取的藥液經(jīng)減壓濃縮得到比重為1.10左右的麻黃藥液。用與堿化后的麻黃藥液等體積的乙醚萃取3次，所得萃取液經(jīng)乙醚回收后置水浴上蒸干即可得到高純度的麻黃總堿，其純度可達(dá)85%以上。

3 討論

3.1 提取溶媒的選擇經(jīng)預(yù)試驗(yàn)表明，采用水加熱回流提取麻黃堿能得到比較好的提取效果。因此從設(shè)備安全性和生產(chǎn)成本考慮還是選擇水加熱回流提取。

3.2 麻黃堿的測(cè)定采用高效液相色譜法，經(jīng)方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)表明，本方法線性好，精密度高，重現(xiàn)性等都較好，測(cè)得結(jié)果準(zhǔn)確。

3.3 提取率作為中藥制劑的重要考察指標(biāo);中藥制劑是粗中取精，最大程度地將藥材中有效成分提取出來(lái)，因此將提取率和麻黃總堿含量作為關(guān)鍵性指標(biāo)。

3.4 無(wú)水乙醚萃取麻黃堿得率高，因乙醚為二級(jí)溶劑，因此特地進(jìn)行了乙醚殘留量測(cè)定，經(jīng)氣相檢測(cè)麻黃總堿中沒(méi)有乙醚殘留。這與乙醚本身物理性狀密切相關(guān)，乙醚極易揮發(fā)，萃取液經(jīng)回收乙醚后置水浴上蒸干至恒重，即可以得到較高濃度的麻黃堿浸膏(深褐色稠膏)。

［1］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:223.

［2］李明華，殷凱生，朱栓立.哮喘病學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1998:345.

［3］畢殿洲.藥劑學(xué)［M］.4版，北京:人民衛(wèi)生出版社，1999:388.

［4］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:附錄56.

［5］劉貴中.高效液相色譜法測(cè)定鼻炎滴劑中鹽酸麻黃堿的含量［J］.藥物分析雜志，1998，18(5):341.

［6］嚴(yán)曉梁，鄧曉鴻.幾種實(shí)驗(yàn)室提取麻黃堿方法的比較［J］.華西藥學(xué)雜志，1994，9(4):265－267.

R284.2

A

1001－1528(2010)06－0950－03

2009－04－15

浙江省科技廳科研院所研究開(kāi)發(fā)專項(xiàng)(2005F13006)

周丹英(1976－)，女，工程師，主要從事中藥研究。Tel:(0571)85229698 E－mail:zhoudy1976@163.com