施海霞，潘思丹，梁 虹，宋銘晶

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

研究報(bào)告

布氏田鼠封閉群遺傳結(jié)構(gòu)的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分析

施海霞，潘思丹，梁 虹，宋銘晶

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的使用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA標(biāo)記建立標(biāo)準(zhǔn)化的布氏田鼠封閉群遺傳質(zhì)量控制分子標(biāo)記庫(kù)。方法使用高鹽沉淀法從鼠尾中提取布氏田鼠基因組DNA。采用40條 PRAD引物對(duì)布氏田鼠封閉群進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳分離條帶，參考標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記計(jì)算條帶大小，并使用多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單態(tài)位點(diǎn)數(shù)以及多態(tài)位點(diǎn)比率評(píng)價(jià)種群的遺傳多樣性。結(jié)果篩選出8個(gè)能獲得清晰穩(wěn)定擴(kuò)增條帶的 RAPD標(biāo)記。這8個(gè)RAPD標(biāo)記檢測(cè)到的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)存在明顯差異。8個(gè)引物得到的遺傳多態(tài)位點(diǎn)的數(shù)據(jù)之和能揭示種群的遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)建立了檢測(cè)布氏田鼠封閉群遺傳結(jié)構(gòu)的RAPD標(biāo)記。

布氏田鼠;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化;隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA;封閉群

利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行生命科學(xué)研究是假定動(dòng)物個(gè)體間在遺傳上是均質(zhì)的，沒(méi)有差異的。但是實(shí)際上由于遺傳變異，不同個(gè)體在同一座位上形成許多不同的等位基因形式，根據(jù)變異發(fā)生位點(diǎn)的不同可以分為兩種情況:同一基因座位內(nèi)，同一位點(diǎn)上發(fā)生突變形成的一系列等位基因稱為同點(diǎn)等位基因(homoallele);在同一個(gè)基因座位內(nèi)不同位點(diǎn)上發(fā)生突變形成的一系列等位基因稱為異點(diǎn)等位基因(heteroallele)。動(dòng)物群體內(nèi)一個(gè)基因座位的等位基因的成員可以多達(dá)三個(gè)以上，這些等位基因被稱為復(fù)等位基因［1］。因此，個(gè)體間的遺傳差異是普遍存在的，動(dòng)物品系中同一近交系內(nèi)個(gè)體間遺傳差異最小，而封閉群內(nèi)個(gè)體間的遺傳差異較大。我們2007年從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)引入了布氏田鼠(Lasiopodomys brandtii)普通級(jí)實(shí)驗(yàn)室種群，通過(guò)對(duì)該種群的系統(tǒng)藥物凈化和同胞選擇篩選，2010年建立了連續(xù)繁殖5代的清潔級(jí)布氏田鼠封閉群［2］。國(guó)內(nèi)一些實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了布氏田鼠種群的繁殖、生理、生化、免疫以及遺傳結(jié)構(gòu)等方面的一系列研究［3，4］，但對(duì)該物種的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究和應(yīng)用還基本上是空白。我們建立該布氏田鼠封閉群標(biāo)準(zhǔn)化的遺傳質(zhì)量控制分子標(biāo)記，明確種群內(nèi)不同個(gè)體的遺傳背景，對(duì)促進(jìn)布氏田鼠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究具有重要意義。

隨機(jī) 擴(kuò) 增 多 態(tài) DNA(randomlyamplified polymorphic DNA，RAPD)標(biāo)記技術(shù)所用的隨機(jī)引物同基因組DNA序列有其特定的結(jié)合位點(diǎn)，這些結(jié)合位點(diǎn)在基因組的分布如符合PCR擴(kuò)增條件，即在模板的兩條鏈上都有互補(bǔ)位置，且3’端相距在 PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度范圍之內(nèi)，就可擴(kuò)增出片段。如果基因組在這些區(qū)域發(fā)生 DNA片段的插入、缺失或堿基突變，就導(dǎo)致這些結(jié)合位點(diǎn)的分布發(fā)生相應(yīng)的變化。通過(guò)對(duì)RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)就可以快速地檢測(cè)到基因組DNA在這些區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性，并且所需模板DNA的量較少，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)成本低，在動(dòng)植物品系鑒定和遺傳多樣性的分析中已得到廣泛的應(yīng)用［5，6］。本課題利用 RAPD技術(shù)，檢測(cè)布氏田鼠封閉群的遺傳結(jié)構(gòu)，建立遺傳質(zhì)量控制分子標(biāo)記庫(kù)，以便于我們就能監(jiān)測(cè)和控制布氏田鼠封閉群的遺傳多樣性，并依據(jù)布氏田鼠的遺傳背景和實(shí)驗(yàn)的目的為科學(xué)實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

布氏田鼠飼養(yǎng)在獨(dú)立送排風(fēng)凈化動(dòng)物籠(individually ventilated cage，IVC)，飼養(yǎng)室溫度22℃～25℃，濕度50%～70%，光照條件14L:10D，自由攝食和飲水。

1.2 DNA提取

布氏田鼠基因組 DNA來(lái)自自清潔級(jí)布氏田鼠雌雄各25只，采用高鹽沉淀法提取，具體步驟如下:取布氏田鼠尾部組織置于1.5 mL離心管中，加入500 μL裂解液和10 μL蛋白酶K(20 mg/mL)，55℃消化過(guò)夜，待鼠尾組織完全溶解僅有少許尾骨殘骸后，加入300 μL 6 mol/L飽和 Nacl混勻，冰上靜置15 min，12000 r/min離心15 min后取上清，加入與上清等體積的異丙醇沉淀 DNA，70%乙醇清洗兩次，然后倒掉乙醇自然風(fēng)干，100 μL TE溶解沉淀，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) DNA濃度，調(diào)整濃度至 50 ng/μL。

1.3 儀器和試劑

水平電泳儀 (BIO-RAD)、高速離心機(jī)(Beckman)、PCR儀(BIO-RAD)、凝膠圖像分析系統(tǒng)(Tannon)。蛋白酶K購(gòu)自SIGMA公司，Taq DNA聚合酶、10×buffer、MgCl2、dNTP以及 DNA Marker購(gòu)自寶生物有限公司(TaKaRa)。引物在上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 引物的篩選

用40條RAPD引物分別對(duì)隨機(jī)選取的6只布氏田鼠(雌雄各半)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，每個(gè)個(gè)體分別使用25 ng和50 ng進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇那些在調(diào)節(jié)好適宜的模板濃度后在所有個(gè)體均能獲得穩(wěn)定重復(fù)的擴(kuò)增產(chǎn)物的引物用于布氏田鼠種群的RAPD實(shí)驗(yàn)，篩選出的引物和擴(kuò)增產(chǎn)物情況見(jiàn)表1。

1.5 PCR反應(yīng)條件與電泳

20 μL反應(yīng)體系含10×buffer 2 μL，25 mmol/L Mgcl21 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，50 mmol/L引物1 μL，1U Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)入37個(gè)循環(huán)，包括94℃變性1 min，37℃退火30 s，72℃延伸1 min。最后一個(gè)循環(huán)增加72℃延伸10 min。RAPD產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL的溴化乙錠)電泳分離，電泳電壓30V，5 h。紫外線下觀察拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)條帶都記做一個(gè)位點(diǎn)的基因，某位點(diǎn)上有條帶的個(gè)體的等位基因標(biāo)記為1，無(wú)條帶的記為0，所有個(gè)體在該位點(diǎn)都有條帶，即等位基因的頻率等于1，記為單態(tài)位點(diǎn)。多態(tài)位點(diǎn)是指等位基因的頻率小于或等于0.99的位點(diǎn)。多態(tài)位點(diǎn)比率是指其等位基因的頻率小于或等于0.99的位點(diǎn)占本實(shí)驗(yàn)中統(tǒng)計(jì)的所有位點(diǎn)的比率。

2 結(jié)果

本研究用8個(gè)RAPD引物對(duì)50只布氏田鼠進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出 66條帶，都位于 250～2000bp之間，其中多態(tài)片段37條(表1)。部分?jǐn)U增圖譜見(jiàn)圖1～3。

表1 布氏田鼠封閉群遺傳結(jié)構(gòu)分析的RAPD引物及擴(kuò)增情況Tab.1 Sequences of primers used in RAPD assay for closed colony of Brandt's vole

圖1 引物OPT01對(duì)布氏田鼠的RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The RAPD products of the genomic DNA of Lasiopodomys brandtii amplified by OPT01

3 討論

RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的差異可以歸為三類:第一類是來(lái)自個(gè)體某座位在引物結(jié)合區(qū)的突變，造成某片段有無(wú)的差異;第二類是個(gè)體某高變區(qū)的插入和缺失突變，造成個(gè)體間擴(kuò)增片段大小的差異;第三種是顯性純合子與雜合子造成片段擴(kuò)增條帶濃度的差異，但是這種產(chǎn)量的差異也可能是在擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)物隨機(jī)競(jìng)爭(zhēng)產(chǎn)生的，無(wú)法據(jù)此判定該條帶是顯性純合還是雜合，因此，本研究中無(wú)論是弱帶還是強(qiáng)帶都作為有條帶處理，在該基因的位點(diǎn)標(biāo)記為1。

圖2 引物OPT07對(duì)布氏田鼠的RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 The RAPD products of the genomic DNA of Lasiopodomys brandtii amplified by OPT07

圖3 引物OPZ03對(duì)布氏田鼠的RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 The RAPD products of the genomic DNA of Lasiopodomys brandtii amplified by OPZ03

結(jié)果顯示不同引物檢測(cè)到大倉(cāng)鼠種群的多態(tài)位點(diǎn)率明顯不同，引物OPT15、OPT-07和OPT-13檢測(cè)到的多態(tài)位點(diǎn)比率較低，分別是0.364、0.375和0.375。而引物 OPT16和 OPZ03，OPZ07檢測(cè)到的多態(tài)位點(diǎn)率較高，在0.70以上。因?yàn)镽APD標(biāo)記所用的引物是由10個(gè)核苷酸組成的寡核苷酸序列，與模板DNA可能有的結(jié)合位點(diǎn)位點(diǎn)很多，一套引物可以檢測(cè)整個(gè)基因組［7］，如果與引物互補(bǔ)的DNA區(qū)段是保守區(qū)段，那么不同個(gè)體間一般呈現(xiàn)相同的擴(kuò)增產(chǎn)物;如果與高變區(qū)段互補(bǔ)，那么擴(kuò)增產(chǎn)物則表現(xiàn)出個(gè)體間的豐富多態(tài)，所以本研究不同引物檢測(cè)到的多態(tài)位點(diǎn)率的差異，可能源于不同引物所擴(kuò)增的模板DNA的區(qū)域不同。引物OPT-16擴(kuò)增出的片段只有9條，但多態(tài)片段達(dá)到8條，多態(tài)位點(diǎn)比率為0.889，推測(cè)其擴(kuò)增區(qū)域?yàn)楦咦儏^(qū)。而引物 OPT15擴(kuò)增出的片段為11條，但多態(tài)片段最少，只有4條，多態(tài)位點(diǎn)比率為0.364，推測(cè)其擴(kuò)增區(qū)域?yàn)楸Ｊ貐^(qū)。結(jié)果顯示利用不同引物對(duì)這個(gè)布氏田鼠封閉群進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，個(gè)體間的帶型有的比較相似，如OPT-01的擴(kuò)增結(jié)果(圖1)。有的帶型基本一致，只有少部分個(gè)體的部分位點(diǎn)擴(kuò)增出多態(tài)片段，如OPT-07的擴(kuò)增結(jié)果(圖2)。有的帶型存在明顯差異，如OPZ-03的擴(kuò)增結(jié)果(圖3)。引物擴(kuò)增條帶的相似程度反映種群內(nèi)不同個(gè)體間遺傳背景的相似程度。任何一條引物得到的遺傳變異信息都有限，不能區(qū)分出所有個(gè)體，但是8條引物得到的遺傳多態(tài)位點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫(kù)能揭示種群內(nèi)個(gè)體間的遺傳差異和種群的遺傳多樣性。

［1］ 趙壽元，喬守怡.遺傳學(xué)［M］.北京:高等教育出版社，2002: 257－289，290－327.

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RAPD Analysis of the Genetic Structure for Closed Colony of Brandt's Vole

SHI Hai-xia，PAN Si-dan，LIANG Hong，SONG Ming-jing
(Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences(CAMS)＆Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College(PUMC)，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo establish the he genetic structure for cultivation population of Brandt's vole (Lasiopodomys brandtii)by RAPD(randomly amplified polymorphic DNA)assay.Method Genomic DNA was extracted from tail tip following high-concentration-salt precipitation methods.40 RAPD primers were PCR amplified to analyze the DNA structure of Brandt's vole population.RAPD markers were separated by agarose gel electrophoresis.Alleles were determined according to a size marker.Monomorphic site，polymorphic site and the proportion of polymorphic loci，were used to describe the genetic variation of Brandt's vole population detected by RAPD。ResultsThe rates of variation of RAPD loci by 8 primers used in this study are different.The combination of the PCR bandings by eight RAPD primers can provide sufficient statistical power to assess the genetic variations in Brandt's vole population。ConclusionWe have successfully established genetic methods for analyzing genetic structure of closed colony of Brandt's vole.

Brandt's vole;Cultivation;RAPD;Closed colony

R394.5

A

1671-7856(2010)07-0049-04

2010-03-31

高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20070023119)，中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金(DWS200702)，以及國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2009BAI83B01)子課題資助。

施海霞，女，初級(jí)實(shí)驗(yàn)技師。

宋銘晶。E-mail:songmj@cnilas.org