馬俊鵬，韓海霞，郭喜紅，吳繼周，包曉瑋，張倩（.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊市 8000；.新疆農(nóng)業(yè)大學藥學院，烏魯木齊市 8005；.新疆博爾塔拉自治州藥品檢驗所，博樂市 8400）

正交試驗優(yōu)選啤酒花總黃酮提取工藝

馬俊鵬1＊，韓海霞2，郭喜紅1，吳繼周3，包曉瑋2，張倩2（1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，烏魯木齊市 830001；2.新疆農(nóng)業(yè)大學藥學院，烏魯木齊市 830052；3.新疆博爾塔拉自治州藥品檢驗所，博樂市 833400）

目的：優(yōu)選啤酒花總黃酮的提取工藝。方法：以乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數(shù)為考察因素，以總黃酮含量為指標，采用正交試驗優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果：啤酒花總黃酮的最佳提取工藝為乙醇濃度60%、提取時間80 min、料液比1∶25、提取次數(shù)3次。結(jié)論：該提取工藝簡便、快捷，適用于啤酒花總黃酮的提取。

啤酒花；總黃酮；提取工藝；正交試驗

啤酒花（Humunus lupulusL.）是大麻科草屬多年生草質(zhì)蔓生藤本，雌雄異株，花單性，雌性球穗花序簡稱酒花。主要分布于我國西北、東北、華東等地，含有樹脂類、揮發(fā)油、總黃酮、多酚等多種化學成分。研究表明，啤酒花提取物及其復方制劑具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)靜、雌性激素樣等多種生物活性，在臨床上常用于治療結(jié)核、神經(jīng)衰弱、麻風等多種疾病[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，啤酒花中黃腐酚、異黃腐酚、五羥黃酮等總黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗血栓、植物雌激素樣、降壓等藥理作用[2，3]。因此，開發(fā)啤酒花總黃酮在醫(yī)藥、食品和保健品等領(lǐng)域的新用途，將成為今后啤酒花總黃酮研究的重點。目前，國內(nèi)、外對其提取工藝研究較少，筆者采用乙醇為提取溶劑，以總黃酮含量為評價指標，通過正交試驗優(yōu)選啤酒花總黃酮的最佳提取工藝，為啤酒花總黃酮的分離純化、以啤酒花為原料開發(fā)藥物奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

SHB-Ⅲ型循環(huán)水多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RE-52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6090型真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；751型可見分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）；AL104-IC型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；JJ-140w型電動攪拌器（上海冠戈實業(yè)有限公司）；80-2型臺式低速離心機（江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試藥

啤酒花采自新疆昌吉農(nóng)田，由新疆農(nóng)業(yè)大學天然藥物教研室鑒定為真品，室溫陰干，置鼓風干燥箱中70℃烘干，粉碎，過60目網(wǎng)篩，保存于陰暗處，備用；蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080-200707）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 啤酒花總黃酮的含量測定

2.1.1 提取方法：準確稱取適量啤酒花粉末于燒瓶中，加入25倍量體積的60%乙醇溶液，60℃水浴回流提取3次，每次80 min，過濾，合并濾液，離心，上清液濃縮，將濃縮液置于100 mL容量瓶中，用60%乙醇加至刻度，搖勻，得啤酒花總黃酮提取液。

2.1.2 蘆丁對照品溶液的制備：稱取蘆丁對照品適量，干燥至恒重，精密稱取10.00 mg，加60%熱乙醇使其溶解并定容至100 mL，搖勻，制成0.1 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。

2.1.3 啤酒花總黃酮供試品溶液的制備：精密吸取5.0 mL啤酒花總黃酮提取液，置于150 mL容量瓶中，用60%乙醇定容，得啤酒花總黃酮供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察：分別精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁對照品溶液，參照文獻[4]方法顯色并制備空白溶液后在510 nm波長處測定吸光度。以蘆丁濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A＝13.529C+ 0.005 9（r＝0.999 4）。結(jié)果表明，蘆丁在0.005～0.05 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)與其吸光度線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗：精密吸取蘆丁對照品溶液4.5 mL，置于10 mL量瓶中，參照文獻[4]方法顯色并制備空白溶液后在510 nm波長處測定吸光度，平行操作5次。結(jié)果，RSD＝0.14%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗：稱取同一批次啤酒花藥材粉末6份，分別按“2.1.1”、“2.1.3”項下方法制備啤酒花總黃酮供試品溶液，參照文獻[4]方法顯色并制備空白溶液后在510 nm波長處分別測定吸光度，計算啤酒花總黃酮含量。結(jié)果，RSD＝1.75%，表明方法重復性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗：精密吸取9份啤酒花總黃酮供試品溶液各5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，分別加入蘆丁對照品溶液2.0、4.0、6.0 mL，配成低、中、高濃度溶液各3份，再參照文獻[4]方法分別顯色后測定其吸光度，計算加樣回收率。結(jié)果，平均加樣回收率為99.8%，RSD＝1.64%（n＝9）。

2.1.8 總黃酮含量的測定：精密量取啤酒花總黃酮供試品溶液適量，參照文獻[4]方法顯色后測定其吸光度，代入回歸方程，計算總黃酮含量。

2.2 啤酒花總黃酮最佳提取工藝的優(yōu)選

2.2.1 正交試驗設計：為尋求最佳提取條件組合，在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）和提取次數(shù)（D）為考察因素，以總黃酮含量為指標，進行L9（34）正交試驗。因素水平見表 1；正交試驗結(jié)果見表 2；方差分析結(jié)果見表3。

由表2、表3可知，各因素影響程度依次為D＞C＞A＞B，即提取次數(shù)＞料液比＞乙醇濃度＞提取時間；乙醇濃度（A）、料液比（C）、提取次數(shù)（D）對提取率有顯著影響。因此，選擇最佳提取工藝條件為A2B1C2D3，即乙醇濃度為60%，提取時間為80 min，料液比為1∶25，提取3次。

2.2.2 驗證試驗：分別精密稱取3批啤酒花各1.0 g，按上述最佳提取工藝條件提取，按“2.1.8”項下方法測定含量。結(jié)果，3批啤酒花總黃酮含量分別為37.82、37.99、38.04 mg·g-1，RSD＝0.3%（n＝3），表明提取工藝合理、穩(wěn)定、可行。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗結(jié)果Tab 2 Results of orthogonal experiments

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

3 討論

中藥材通常采用浸泡、回流、超聲輔助回流等方法進行提取。啤酒花藥材中主要化學成分為黃酮類化合物，一般采用極性較大的溶劑（如甲醇、乙醇、水等）進行提取。筆者通過預試驗比較了甲醇、乙醇、水作為提取溶劑的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇提取效率高于甲醇和水；又比較了溶劑浸泡法、回流法和超聲輔助回流法3種方法的提取效率，從節(jié)約成本、時間和可行性角度考慮，最終選擇乙醇為提取溶劑，直接回流法作為啤酒花總黃酮的提取方法。

筆者曾進行了啤酒花藥材粒度、乙醇濃度、提取時間、提取溫度、料液比、提取次數(shù)的單因素篩選試驗，結(jié)果表明啤酒花藥材粒度、提取溫度對提取效率影響不大，故選擇對提取效率影響較大的乙醇濃度、提取時間、料液比、提取次數(shù)為考察因素，設計了正交試驗，優(yōu)選最佳提取工藝條件。

[1]周娟，鄒翔，季宇彬.啤酒花的有效成分及活性研究[J].哈爾濱商業(yè)大學學報（自然科學版），2005，21（4）：414.

[2]駱懷民，李琳.多酚物質(zhì)和酒花苦味物質(zhì)的研究[J].啤酒科技，2002，9：66.

[3]朱丹，牛廣財，姜述君，等.酒花的化學成分及藥理作用[J].中國藥業(yè)，2008，19（21）：1.

[4]王軍民，韓麗琴，董順福.黃芩中金屬元素與總黃酮的含量測定[J].中國藥房，2007，18（21）：1 641.

Optimization of the Extraction Technology of Total Flavonoids fromHumulus lupulusby Orthogonal Experiment

MA Jun-peng，GUO Xi-hong（Dept.of Pharmacy，People’s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China）
HAN Hai-xia，BAO Xiao-wei，ZHANG Qian（College of Pharmacy，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China）
WU Ji-zhou（Bortala Mongol Autonomous Prefecture Institute for Drug Control，Bole 833400，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of the total flavonoids fromHumulus lupulus.METHODS：The extraction technology of total flavonoids was optimized by orthogonal experiment with the content of total flavonoids as index and with ethanol concentration，the ratio of material and solvent，extracting time and extracting frequency as factors.RESULTS：The optimal extraction technology was as follow：the concentration of ethanol was 60%；the extracting time was 80 min；the ratio of material to solvent was 1∶25 and extracting frequency was 3 times.CONCLUSION：The extraction technology is simple and rapid for the extraction of total flavonoids fromH.lupulus.

Humulus lupulus；Total flavonoids；Extraction technology；Orthogonal experiment

R 283；R284

A

1001-0408（2010）11-0994-03

2009-04-25

2009-10-12）