李長(zhǎng)龍，盧領(lǐng)群，郭紅剛，柯賢福，戴方偉，薩曉嬰

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，杭州 310013)

研究報(bào)告

長(zhǎng)爪沙鼠線粒體DNA控制區(qū)全序列測(cè)定及分析

李長(zhǎng)龍，盧領(lǐng)群，郭紅剛，柯賢福，戴方偉，薩曉嬰

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，杭州 310013)

目的對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠線粒體DNA控制區(qū)全序列進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其進(jìn)行鑒定及進(jìn)化分析。方法根據(jù)長(zhǎng)爪沙鼠已知基因序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR產(chǎn)物測(cè)序法，對(duì)所得的片段進(jìn)行測(cè)序鑒定。結(jié)合已公布嚙齒類動(dòng)物D-loop區(qū)序列，分析其堿基組成、遺傳距離、并基于最小進(jìn)化法和UPGMA法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果獲得長(zhǎng)爪沙鼠D-loop區(qū)序列，其與家鼠、小家鼠和倉鼠平均同源性為58%;堿基組成分析顯示，長(zhǎng)爪沙鼠與嚙齒類動(dòng)物有相似的堿基組成和堿基偏離，其A-skew和G-skew分別為0.0047和－0.28。進(jìn)化分析結(jié)果顯示，長(zhǎng)爪沙鼠與家鼠(0.35)、黑家鼠(0.38)和倉鼠(0.39)具有較近的遺傳距離，其分化順序?yàn)樘?、蔗鼠、長(zhǎng)爪沙鼠、倉鼠、家鼠和小家鼠。結(jié)論

本研究獲得長(zhǎng)爪沙鼠D-loop區(qū)全序列，確定了長(zhǎng)爪沙鼠與倉鼠、家鼠、小家鼠及其它嚙齒動(dòng)物的進(jìn)化關(guān)系，為長(zhǎng)爪沙鼠進(jìn)化研究、線粒體的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。

長(zhǎng)爪沙鼠;D-loop區(qū);序列測(cè)定;進(jìn)化分析

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是高等動(dòng)物唯一的核外遺傳物質(zhì)，呈共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)。與核基因組相比，線粒體基因組結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快(是單拷貝核基因的5～10倍)，呈嚴(yán)格的母性遺傳，遺傳行為相對(duì)獨(dú)立，變異發(fā)生的幾率相對(duì)穩(wěn)定、無組織特異性、提取方便［1］。由于mtDNA的這些獨(dú)特遺傳特性，已被廣泛地用于物種起源與進(jìn)化、生物分類、及群體遺傳結(jié)構(gòu)等方面的研究［2－4］。在進(jìn)化分析時(shí)，研究者往往選擇不同的區(qū)域進(jìn)行不同時(shí)間尺度的進(jìn)化分析。線粒體控制區(qū)(D-loop region)是mtDNA中進(jìn)化最快、變化最復(fù)雜的區(qū)域，常用于種內(nèi)或種間遺傳分化研究［5］。對(duì)線粒體D-loop區(qū)結(jié)構(gòu)和功能的研究不僅將有助于了解DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的機(jī)制和進(jìn)化規(guī)律研究，而且對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)和功能研究也具有很大意義［6］。

長(zhǎng) 爪 沙 鼠 (Mongolian gerbil， Meriones unguiculatus)俗稱蒙古沙鼠，屬于嚙齒目，倉鼠科，沙鼠亞科，沙鼠屬，又稱長(zhǎng)爪沙土鼠、蒙古沙鼠和黃耗子等，野生長(zhǎng)爪沙鼠主要分布于我國內(nèi)蒙古及其毗鄰的干旱和半干旱地區(qū)［7］。1935年大連衛(wèi)生所的春日送給日本北里研究所20對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠并開始馴化，后引種到美、英、法等國。日本國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(NIBIO)現(xiàn)已培育成3個(gè)長(zhǎng)爪沙鼠近交系［8］。我國有兩個(gè)主要的長(zhǎng)爪沙鼠群體，分別保存于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和首都醫(yī)科大學(xué)［7］。長(zhǎng)爪沙鼠具有獨(dú)特的解剖學(xué)、生理學(xué)和行為學(xué)性狀，對(duì)于一些疾病(如:腦缺血、癲癇、高血脂、寄生蟲、細(xì)菌、病毒和老年性疾病等)的研究具有極為重要的價(jià)值［9-11］。長(zhǎng)爪沙鼠被認(rèn)為是研究脂質(zhì)代謝良好的模型動(dòng)物［7，8，12，13］，在越來越多的研究所使用。但是，國內(nèi)外對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠線粒體D-loop區(qū)的研究還未見報(bào)道。本研究對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠線粒體 D-loop區(qū)全序列進(jìn)行測(cè)定和鑒定，并結(jié)合已公布嚙齒類動(dòng)物D-loop區(qū)序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，旨在為長(zhǎng)爪沙鼠系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系提供遺傳學(xué)資料，為全長(zhǎng)線粒體測(cè)定分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

長(zhǎng)爪沙鼠來自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(浙)2008-033;使用許可證號(hào):SYXK (浙)2008-0014)，長(zhǎng)爪沙鼠解剖采集肝臟樣品，－20℃保存。

1.2 總DNA提取

采用酚氯仿抽提法提取基因組DNA，0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，－20℃保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增

分別參照長(zhǎng)爪沙鼠 mtDNA序列 AB381901和AJ851249設(shè)計(jì)上下游引物［14，15］，引物由上海生工合成。上游(cyt B 3′端)5’-ATCGGACAAGTCGCT TCAAT-3’，下游(12S 5′端)5’-AGCGATGGCTCG TAGTTCTC-3’。

擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為25 μL:模板DNA 100 ng、10×buffer 2.5 μL、MgC12(2.5 mol/L)2 μL、dNTP 2 μL、上下游引物(10 pmol/L)各1 μL、1 U pfuDNA聚合酶，加滅菌純水補(bǔ)足。擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56.5℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。

1.4 序列純化、測(cè)序、拼接

用北京天根凝膠回收試劑盒對(duì) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物由上海美季公司完成測(cè)序工作，Chromas 2.22校對(duì)測(cè)序圖，DNAMAN5.5拼接序列。

1.5 序列的鑒定和分析

圖1 PCR擴(kuò)增長(zhǎng)爪沙鼠線粒體D-loop區(qū)Fig.1 The results of PCR amplified D-loop region in Mongolian gerbil.

從GenBank下載其他嚙齒類動(dòng)物類mtDNA控制區(qū)序列，GenBank登錄號(hào)分別為:NC_005089家鼠(Mus musculus)、NC_012387小家鼠(Mus musculus castaneus)、NC_006914西歐家鼠(Mus musculus domesticus)、NC_006915日本小鼠(Mus musculus molossinus)、NC_010339東歐家鼠(Mus musculusmusculus)、NC_012389緬鼠(Rattus exulans)、NC_ 012461帥家鼠(Rattus praetor)、NC_012374黑家鼠(Rattus rattus)、NC_011638達(dá)氏家鼠 (Rattus tanezumi)、AC_000022褐家鼠(Rattus norvegicus)、NC_013068大倉鼠(Tscherskia triton)、NC_007936中國倉鼠(Cricetulus griseus)、NC_003041臺(tái)灣田鼠(Microtus kikuchii)、NC_001892胖睡鼠(Glis)、NC_ 005314非洲跳鼠(Jaculus)、NC_009056鱗尾松樹(Anomalurus)、NC_000884豚鼠(Cavia porcellus)和NC_002658蔗鼠(Thryonomys swinderianus)等18條全長(zhǎng) mtDNA序列中 D-loop序列進(jìn)行分析。用DNAMAN5.5進(jìn)行同源性分析;用 EMBOSS中compseq程序統(tǒng)計(jì)堿基含量和計(jì)算A和G偏離［16］;用MEGA 4.1統(tǒng)計(jì)物種間遺傳距離，并基于Kimura-Parameter雙參數(shù)模型，用UPGMA和最小進(jìn)化法構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹［17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 D-loop區(qū)序列組成

PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，特異性擴(kuò)增約1.5 kb的片段(圖1)。除去兩端不準(zhǔn)確的部分，共測(cè)得長(zhǎng)爪沙鼠mtDNA序列1 677 bp，其中包括D-Loop區(qū)全序列、tRNA-Phe、tRNA-Val、tRNA-Thr、tRNA-Pro基因部分序列。序列分析顯示，長(zhǎng)爪沙鼠線粒體 D-loop區(qū)序列全長(zhǎng)為997 bp(圖2)，堿基A、C、G、T的含量分別為32.1%、23.2%、12.9%、31.8%;A +T(63.9%)含量大于G+C(46.1%)含量。A-skew的范圍為0.15(松鼠)至-0.034(臺(tái)灣田鼠); G-skew的范圍為－0.17(豚鼠)至 －0.41(睡鼠)。長(zhǎng)爪沙鼠的 A-skew和 G-skew分別為 0.0047和－0.28，A和G偏離明顯(圖3)。

2.2 長(zhǎng)爪沙鼠D-loop區(qū)序列鑒定

長(zhǎng)爪沙鼠與其他嚙齒動(dòng)物的 D-loop序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，家鼠(97%)、小家鼠(83%)和倉鼠(68%)動(dòng)物均具有較高同源性，長(zhǎng)爪沙鼠與上述三種動(dòng)物的同源性為 58%。鑒于 D-loop是DNA中進(jìn)化最快的部分，說明該序列為長(zhǎng)爪沙鼠線粒體D-loop區(qū)(圖4)。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的建立及遺傳距離計(jì)算

圖2 長(zhǎng)爪沙鼠D-loop區(qū)序列Fig.2 The complete sequence of D-loop region in Mongolian gerbil

基于D-loop區(qū)全序列，用鄰接法和最小進(jìn)化法構(gòu)建相關(guān)動(dòng)物系統(tǒng)進(jìn)化樹得到基本一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖5，圖6)。結(jié)果顯示，進(jìn)化樹主要有了兩個(gè)分支，A分支由家鼠、小家鼠、倉鼠、長(zhǎng)爪沙鼠、蔗鼠和睡鼠構(gòu)成;在A分支內(nèi)，家鼠、小家鼠、倉鼠分別聚合后依次與長(zhǎng)爪沙鼠、蔗鼠和跳鼠聚合。家鼠、小家鼠、西歐家鼠、日本小鼠和東歐家鼠集中在小家鼠分支上。緬鼠、帥家鼠、黑家鼠、達(dá)氏家鼠和褐家鼠集中在家鼠分支上。大倉鼠、中國倉鼠和臺(tái)灣田鼠集中在倉鼠分支上。B分支由松鼠、豚鼠和跳鼠聚合而成。結(jié)果說明嚙齒動(dòng)物的線粒體控制區(qū)序列包含了重要的系統(tǒng)發(fā)育信息。枝長(zhǎng)表示分歧度，枝上的數(shù)值為 1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)得到的支持率。選擇家鼠、黑家鼠和中國倉鼠分別代表家鼠、小家鼠和倉鼠與長(zhǎng)爪沙鼠計(jì)算遺傳距離。結(jié)果顯示(表1)，長(zhǎng)爪沙鼠與黑家鼠遺傳距離最近為0.35;與家鼠遺傳距離為0.37;與中國倉鼠遺傳距離為0.39。結(jié)果表明長(zhǎng)爪沙鼠與黑家鼠最近的親緣關(guān)系，與家鼠較近的親緣關(guān)系，與豚鼠親緣關(guān)系最遠(yuǎn)為0.49。

圖4 長(zhǎng)爪沙鼠與其他嚙齒類動(dòng)物的同源性分析Fig.4 The homology analysis between Mongolian gerbil and other rodents

圖5 M-E法構(gòu)建的D-loop基因系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.5 Phylogenetic tree based on D-loop region sequences generated by minimum-evolution methods.

圖6 UPGMA法構(gòu)建的D-loop基因系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.6 Phylogenetic tree based on D-loop region sequences generated by UPGMA methods.

3 討論

3.1 長(zhǎng)爪沙鼠D-loop區(qū)序列的測(cè)定和鑒定

mtDNA是閉合的雙鏈環(huán)狀DNA，D-loop區(qū)位于mtDNA復(fù)制起點(diǎn)(終點(diǎn))前，在cyt B和12S基因之間。本研究根據(jù)已有的長(zhǎng)爪沙鼠線粒體cyt B和12S基因序列分別設(shè)計(jì)上下游引物，并在線粒體基因組DNA中擴(kuò)增出約1.5 kb的DNA片段(圖1)。經(jīng)過重復(fù)雙向測(cè)序，結(jié)果拼接后獲得長(zhǎng)1 677 bp的DNA片段。序列中去除轉(zhuǎn)運(yùn)RNA后獲得997 bp序列。為了鑒定該序列，本研究選擇18種不同的嚙齒類動(dòng)物線粒體D-loop區(qū)序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，長(zhǎng)爪沙鼠與家鼠、小家鼠和倉鼠的平均同源性為58%。D-loop區(qū)是mtDNA中高度變異的非編碼區(qū)，進(jìn)化速率是mtDNA其它區(qū)域的3～5倍［18］，據(jù)此，該序列為長(zhǎng)爪沙鼠全長(zhǎng)D-loop區(qū)序列。

3.2 長(zhǎng)爪沙鼠D-loop區(qū)序列及進(jìn)化分析

動(dòng)物的起源進(jìn)化長(zhǎng)期以來一直困擾著遺傳學(xué)家。分子遺傳學(xué)方法為研究群體的起源和進(jìn)化開辟了新的途徑［19］。mtDNA具有很多的特性，利用mtDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生數(shù)能很好的反映動(dòng)物母系的遷徙和進(jìn)化。mtDNA比核DNA的突變率高5～10倍，其中的 D-loop區(qū)是線粒體基因組進(jìn)化速率最快的區(qū)域，進(jìn)化速率是mtDNA其他區(qū)域的3～5倍［18］。許多科學(xué)家利用 mtDNA序列差異來研究動(dòng)物的遺傳多樣性與起源演化。Giufra對(duì)歐洲野豬、歐洲家豬、亞洲野豬和中國梅山豬 mtDNA D-1oop區(qū)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)家豬有歐洲野豬和亞洲野豬兩個(gè)母系起源并證實(shí)歐洲大白豬是亞洲豬和歐洲豬的雜交種，該結(jié)果與18～19世紀(jì)初亞洲豬被引入歐洲的歷史記載相符［20］。在近年來，動(dòng)物 mtDNA研究取得了一系列令人矚目的成果。

不同物種的mtDNA堿基組成和特性存在明顯的差異［21］。DNA的鳥嘌呤和胞嘧啶的堿基含量(G +C含量)在不同物種的基因組中波動(dòng)范圍廣闊［22，23］，甚至在同一物種的基因組不同區(qū)域也不相同。這種基因組局部堿基不均衡的現(xiàn)象表現(xiàn)為不同區(qū)域的核苷酸堿基組成存在差異［24］。長(zhǎng)爪沙鼠 D-loop區(qū)序列A、C、G、T的含量分別為32.1%、23.2 %、12.9%、31.8%，其中G的含量顯著低于其他堿基的含量，這是mtDNA的一個(gè)顯著特征［25］;A+ T(63.9%)含量大于G+C(46.1%)含量，與其他哺乳動(dòng)物 A、T含量高，G、C含量低的特點(diǎn)相似［26］。長(zhǎng)爪沙鼠的 A-skew和 G-skew分別為0.0047和 －0.28(圖3)。與長(zhǎng)爪沙鼠遺傳距離較近的動(dòng)物在堿基組成和A和G偏離上較為接近，具有明顯的種屬特異性。

表1 長(zhǎng)爪沙鼠與其他鼠類遺傳距離Tab.1 The genetic distance between Mongolian gerbil and other rodents

Chevret等曾利用DNA在溶解溫度的方法研究長(zhǎng)爪沙鼠與家屬和小家鼠的進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果顯示長(zhǎng)爪沙鼠與家屬和小家鼠存在較相近的進(jìn)化關(guān)系［27］。Colangelo等利用 cyt B和16S rRNA序列研究非洲沙鼠的分子進(jìn)化關(guān)系［28］;Chevret等利用 cyt B和12S rRNA基因序列研究沙鼠亞科內(nèi)分子進(jìn)化關(guān)系［29］。本研究應(yīng)用MEGA 4.1軟件，基于D-loop區(qū)全序列，用鄰接法和最小進(jìn)化法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹得到基本一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖5，6)，結(jié)果顯示，家鼠、小家鼠和倉鼠等動(dòng)物均分別各自聚合到同一個(gè)分支上來，之后依次與長(zhǎng)爪沙鼠、蔗鼠和睡鼠聚合在一起。結(jié)果表明，長(zhǎng)爪沙鼠與家鼠、小家鼠和倉鼠有具有相近的親緣關(guān)系。遺傳距離計(jì)算結(jié)果驗(yàn)證了進(jìn)化分析結(jié)果，長(zhǎng)爪沙鼠與褐家鼠最近的親緣關(guān)系，說明家鼠較近的親緣關(guān)系，與豚鼠親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。其分化順序?yàn)樘?、蔗鼠、長(zhǎng)爪沙鼠、倉鼠、家鼠和小家鼠。以上數(shù)據(jù)根據(jù)動(dòng)物單一個(gè)體的D-loop區(qū)序列計(jì)算得出，進(jìn)一步研究應(yīng)增加每種動(dòng)物數(shù)量，并綜合線粒體基因組信息和考古學(xué)等其他數(shù)據(jù)綜合分析。

3.3 長(zhǎng)爪沙鼠線粒體研究展望

線粒體是細(xì)胞的“能量工廠”，多數(shù)細(xì)胞內(nèi)90%的氧消耗在線粒體內(nèi)進(jìn)行［30］。線粒體序列的測(cè)定將為分子進(jìn)化、能量代謝及相關(guān)疾病研究奠定基礎(chǔ)。長(zhǎng)爪沙鼠是一種正在廣泛應(yīng)用的多功能實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。特別是長(zhǎng)爪沙鼠的脂質(zhì)代謝與其它實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在明顯差異，但是與人類又有很大的相似之處，是研究人類脂質(zhì)代謝良好的動(dòng)物模型［7，8，12，13］。長(zhǎng)爪沙鼠線粒體 D-loop區(qū)序列的測(cè)定和進(jìn)化分析不但為長(zhǎng)爪沙鼠進(jìn)化研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，而且為獲得全長(zhǎng)mtDNA序列奠定基礎(chǔ)，為長(zhǎng)爪沙鼠線粒體的結(jié)構(gòu)和功能研究及廣泛應(yīng)用提供保障。

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Determination and Analysis of Mitochondrial DNA D-Loop Region Complete Sequence of Mongolian Gerbil(Meriones unguiculatus)

LI Chang-long，LU Ling-qun，GUO Hong-gang，SA Xiao-ying
(Zhejiang Center of Laboratory Animals，Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 310013，China)

ObjectiveTo determine the complete sequence of mitochondrial D-loop region of Mongolian gerbil based on the PCR products.The sequences were analyzed for phylogenetic tree，nucleotide composition and genetic distance。MethodsThe primer was designed according to the published partial sequences.The PCR products were sequenced and determined.Combined with the known D-loop region sequence of other rodents，nucleotide composition and genetic distance were analysed，and the phylogenetic tree was constructed by minimum-evolution(ME)methods and UPGMA methods。ResultsThere was a high homology(58%)between the sequences of Mongolian Gerbil and that of rat，mouse and hamster.The nucleotide composition of Mongolian Gerbil was similar with that of other rodents.The A-skew and G-skew were 0.0047 and －0.28，respectively.The results of phylogenetic tree analysis showed a higher genetic relationship with rat(0.35)，mouse(0.38)and hamster(0.39).The order of differentiation was cane rat，desert jerboa，Mongolian gerbil，hamster，mouse and rat。Conclusions The mitochondrial D-loop region sequence of Mongolian gerbil has been determined.To our knowledge，it has not been reported in the literature before.In this study，the genetic relationship between Mongolian gerbil and other rodents has been analyzed.The results of this study may be of importance for studies on evolution，structure and function of the mitochondria in Mongolian gerbil.

Mongolian gerbil;D-loop region;Sequence determination;Phylogenetic analysis

R-33

A

1671-7856(2010)04-0040-06

2009-12-17

“十一五”科技支撐重點(diǎn)項(xiàng)目(2009BAI83B02);浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(2008F3021)。

李長(zhǎng)龍(1976－)，男，助理研究員，博士，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳學(xué)，E－mail:li-changlong@126.com。

薩曉嬰(1952－)，男，研究員，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)，E-mail:saxiaoyin@163.com。